Глава 1 развитие структурных и функциональных факторов гетерогенности сократительного аппарата

Анализ проблемы структурно-функциональной гетерогенности миокарда неразрывно связан с изучением сократительного аппарата кардиомиоцитов: состояния миофибрилл в различных зонах и отделах сердца, особенностей его развития и функционирования на этапах онтогенеза, молекулярных основ формирования сократительных структур, регуляции синтеза саркомерных белков, а также энергетики и регуляции сокращения (Pearson, 1982).

Рис.1. Формирование примитивных миофибрилл в субсарколеммальной зоне желудочковых сократительных кардиомиоцитов человека на 6й неделе эмбриогенеза. Ув.: 8000. Mf - миофибрилла; Mt- митохондрия; Sl - сарколемма; L - лизосома; N- ядро.   Стрелками   указаны    полирибосомные комплексы  в локусе активной сборки миофибриллы.

В многочисленных экспериментальных работах отечественных и зарубежных авторов отчетливо показано, что степень структурно-функционального развития миофибрилл заметно различается в желудочковом и предсердном миокарде человека (Г.К. Петухова, 1975; П.П.Румянцев, 1972, 1982; Л.М.Непомнящих и др., 1989; McNutt et al.. 1969; 1974; Legato. 1973) и экспериментальных животных (Page et al.. 1974; Pilny. 1975; Sartore et al., 1978; Irisawa. 1984). Эти различия включают  в частности, существенный гетерогенитет по содержанию миофибрилл, их компоновке и ориентированности в саркоплазме клеток.

Морфологически и ультрацитохимически доказано, что большинство предсердных миоцитов, достоверно относящихся к классу сократительных, не содержат в своем составе каналов Т-системы (Hirakow, 1970; Sommer et al., 1976). В том случае, если элементы T-системы все же удавалось обнаружить, они имели признаки примитивной взаимной ориентации и строения по сравнению с желудочковыми кардиомиоцитами (Ayettey et al., 1978). В морфолого-биохимическом исследовании Р.А.Дробышевой с соавт. (1978) установлено, что ультраструктурные различия между рабочими клетками желудочков и предсердий сочетаются с неодинаковыми источниками энергии и механизмами энергорепродукции в мышечных элементах миокарда крыс.

В количественных морфологических исследованиях изучены отличительные особенности сократительного аппарата кардиомиоцитов левых и правых сосочковых мышц в сердце человека (Mandarim-Lacerda, 1984), левых и правых отделов сердца кошки (Gotoh, 1983), правого и левого желудочков миокарда крыс (В.Л.Горячкина, 1972), различных зон стенки желудочков в сердце человека (Л.М.Непомнящих, 1981).

 Рис. 2. Характер структуры миофибрилл на поперечном срезе сократительных желудочковых кардиомиоцитов в миокарде человека на 7-й неделе эмбриогенеза. Ув.: 48000.

Большой интерес исследователей вызвали онтогенетические аспекты вопроса о формировании градиента различий в признаках развития сократительных структур между отделами сердца. Результаты ультраструктурного анализа механизмов миофибриллогенеза свидетельствуют о том, что в желудочках сердца крысиных эмбрионов самосборка гексагональных миофиламентозных комплексов начинается раньше, чем в предсердиях (Viragh, 1964). Аналогичная закономерность характерна также для миокарда человека: по данным Obrucnik с соавт. (1977; 1978), эмбриональные предсердные миоциты по уровню развития сократительных структур на 7-10 суток отстают от сократительных клеток желудочков. Приведенным выше сведениям в значительной мере противоречат данные других исследователей, в соответствии с которыми дифференцировка предсердных и желудочковых кардиомиоцитов вплоть до 3-й недели эмбриогенеза крыс и до конца эмбрионального развития человека протекает морфологически сходно (Р.А.Дробышева,  1975;  Pager, 1968).

Рис. 3. Ориентация примитивных миофибрилл в суб-сарколеммальной зоне сократительных желудочковых кардиомиоцитов в миокарде человека на 6й неделе эмбриогенеза. Ув.: 14000.

В экспериментах с ранними эмбрионами кур (П.А.Хлопонин, 1976), крыс (David, 1979), мышей (П.П.Румянцев, 1972) и кроликов (Smith et al.. 1977) было показано, что онтогенетические преобразования сократительного аппарата кардиомиоцитов связаны с различной степенью усложнения конфигурации вставочных дисков в предсердном и желудочковом отделах, а также с неодинаковым характером развития fasciae adhaerentes, нексусов и десмосом на контактных поверхностях клеток при изучении левых и правых отделов сердца экспериментальных животных. Напротив, в исследованиях Kim с соавторами (1992) при изучении процессов дифференцировки в миокарде человека в целом отвергается морфологическая гетерогенность между правым и левым желудочками.

На основании многочисленных морфологических данных, обобщенных в обзорах П.П.Румянцева (1982; 1990), можно сделать заключение о том, что механизмы миофибриллогенеза в различных отделах сердца и зонах сердечной стенки осуществляются принципиально сходным образом, однако сведения о степени их выраженности, соотношении и скорости протекания в различных участках миокарда носят противоречивый и зачастую умозрительный характер.

Рис. 4. Скопление актиновых филаментов в паравазальном участке сократительного желудочкового кардиомиоцита в сердце 5-недельного эмбриона человека. ЕС - участок эндотелиальной клетки; Mt- - незрелая митохондрия; Mf - миофибрилла. Стрелками указано скопление актиновых нитей. Ув.: 18000.

В последнее десятилетие для объяснения многочисленных морфологических феноменов при изучении развития сократительного аппарата кардиомиоцитов стали широко использоваться биохимические подходы, направленные на поиск онтогенетических закономерностей в перестройках белкового состава контрактильных структур. Индукция генов сократительных белков находится под контролем общих миогенных дифференцировочных программ (Arai et al., 1992). В цикле работ Л.И.Ковалева с сотрудниками (1986, 1987) с помощью двумерного гель-электрофореза была разработана карта белкового спектра сердечной мышцы мышей (161 фракция); авторы изучили и количественно оценили основные сдвиги белкового состава кардиомиоцитов на этапах эмбрионального и постнатального развития. Б последующих публикациях, вышедших из этой лаборатории, была представлена белковая карта миокарда человека, насчитывающая 213 фракций (Е.В.Пуляева и др.. 1990), а также проанализированы сдвиги "мажорных" белков миокарда человека на этапах онтогенеза (М.Н. Цветкова и др., 1992). Показано, в частности, что по 8 изомолекулярным формам белки предсердий отличаются от желудочкового спектра; при этом в левом желудочке обнаруживалось 6 электрофоретических вариантов протеинового спектра, что было обозначено авторами как формирование белкового полиморфизма. По мнению авторов, существенное снижение количества белковых фракций в пренатальном онтогенезе связано с регрессией эмбриональных генов.

Рис. 5. Участок саркоплазмы сократительной клетки с выраженным накоплением актиновых фибрилл (указаны стрелками). Желудочковый миокард человека на 7й неделе эмбриогенеза. Ув.: 16000.

Изучение собственно сократительных белков (в составе саркомеров) показало, что в раннем постнатальном развитии кроликов миофибриллярные белки левого желудочка накапливаются в 2,5 раза быстрее, чем правого (Robinson et al., 1990). При этом фракционная скорость синтеза тяжелых цепей миозина не имела достоверных отличий в желудочках. Авторы полагают, что скоростные различия в синтезе саркомерных белков играют роль в направленной перестройке гемодинамики в раннем постзмбриональном периоде.

Важным событием, сопровождающим формирование миофибрилл в раннем эмбриогенезе, является смена изомолекулярных форм различных сократительных белков. По данным ДНК-РНК гибридизации, в миокарде крыс a-скелетный и a-сердечный изогены актина экспрессируются знутриутробно; к моменту рождения мРНК a-скелетного актина составляет около 40% от суммарного ее количества и в течение 1й недели жизни крыс резко снижается (Schwartz et al., 1992; Carrier, 1992). При этом доминирующей в постэмбриональном сердце становится a-сердечная изомолекулярная форма актина. Экспрессия двух изоформ саркомерных актинов в сердце крыс и человека регулируется возрастными, гормональными и гемодинамическими стимулами (Boheler et al.. 1991). В опытах с микроинъекциями флюоресцентного актина в саркоплазму культивируемых кардиомиоцитов обнаружено, что белок встраивается в 1-диски за 4-5 секунд после инъекции, причем максимальное количество a-актина накапливается в зонах прикрепления миофибрилл к торцевым участкам сарколеммы (Imanaka-Ioshida et al.. 1993). Напротив, в исследованиях Kouchi с сотрудниками (1993) представлены данные о преимущественном накоплении меченого актина на уровне А-полосы миофибрилл на протяжении 4 минут после инъекции.

Рис.1.6. А - участок миокарда левого желудочка человека на 8й неделе эмбриогенеза. Ув.; 4000

Роль актина в жизнедеятельности кардиомиоцитов не ограничивается лишь структурным участием в синтезе миофибрилл. В экспериментах Donath с сотрудниками (1994), проведенных на культивируемых кардиомиоцитах крыс, было показано, что стимуляция саркомерогенеза сопровождается подавлением синтеза несаркомерной формы a-актина, названной автором "гладкомышечной". Указанные белки объединяются в стресс-подобные структуры, которые, по мнению автора, участвуют в развитии гипертрофии. Распределение несаркомерного a-актина в саркоплазме имеет сетеподобную структуру (Stasaki et al., 1989). Детальное описание стресс-подобных комплексов в саркоплазме культивируемых недифференцированных кардиомиоцитов представлено в работе Handel с соавторами (1991), которые, изучив их белковый состав и распределение в клетках, обнаружили в составе "стрессовых" фибрилл молекулы тропомиозина и титина и поставили вопрос о значении понятия "саркомерные" белки в отношении миофибриллогенеза.

В некоторых иммуноцитохимических исследованиях обнаруживаются сведения о существовании в саркоплазме культивируемых кардиомиоцитов исчерченных и неисчерченных миофибрилл (Lu et al., 1992; Schultheiss et al., 1990); и те и другие включают тропонин I и некоторые минорные белки, способные регулировать сократительную способность указанных структур. В исследованиях Lin с соавторами (1989) были описаны так называемые "переходные полигоны" в культуре диссоциированных кардиомиоцитов куриных эмбрионов, а также проведено сопоставление их белкового состава с протеиновым спектром "истинных" стресс-фибрилл в распластывающихся фибробластах и гладкомышечных клетках. Показано, в частности, что "полигоны" содержат мышечные изоформы a-актина, a-актинин и винкулин, в отличие от истинных стресс-фибрилл, содержащих немышечные сократительные изоформы. В опытах с кардиомиоцитами новорожденных крыс обнаружилось, что стрессовые фибрилла-подобные структуры обладают способностью взаимодействовать с цитоскелетом, а также участвовать в узнавании и взаимодействии с элементами внеклеточного матрикса (Hilenski et al.. 1991).

Рис. 6 (Продолжение). Б-Д. фрагменты саркоплазмы, указанные рамками на рисунке 1.6А. Стрелками показаны скопления актиновых филаментов. Ув.: 24000.

Адаптационные изменения клетки во многом обусловлены полимеризацией глобулярной формы актина и перестройками взаимодействующих с ним белков (Н.А.Онищенко, 1991). Глобулярный актин составляет 13-19% общего мембранного белка, организует цитоскелет и обладает способностью связывать АТФ и Са2+ (Korn, 1982). По данным Therian с сотрудниками (1984), способность актиновых молекул к полимеризации-деполимеризации позволяет регулировать скорость и направление обменных процессов. Кроме того, полимеризация актина способствует фиксации состояния клетки (Sharp et al., 1993), упорядочивает структуру цитоплазмы (Sugi et al.. 1991), увеличивает количество ориентированных поверхностей с локализацией на них дополнительных ферментных комплексов (Therian, 1984).

Важная роль в регуляции сократительной активности миофибрилл кардиомиоцитов принадлежит группе тропонинов (I. С, Т). Показано, что в эмбриональном развитии кур в составе актомиозинового комплекса на фоне количественного нарастания мРНК тропонина Т (Mesnard et al., 1993) происходит замена "медленной" скелетной изоформы на "быструю" сердечную форму тропонина Т (Martin et al., 1991). Аналогичная закономерность смены скелетных изомолекулярных форм сердечными установлена для тропонина I в миокарде человека (Bhavsar et al., 1991; Sasse et al., 1993) и крыс (Godt et al., 1991), а также для тропонина С в миокарде мышей (Nagai et al.. 1993) и кроликов (McAuliffe et al., 1990).

Следует отметить, что наряду с приведенными данными в литературе встречаются публикации, противоречащие выявленной закономерности. Так, например, в исследованиях McAuliffe с сотрудниками (1991), проведенных на фетальном и постнатальном миокарде овец, была обнаружена лишь одна изоформа тропонина Т. которая начинала экспрессироваться с середины беременности и в течение всей жизни животных. При этом, однако, авторы не уточняли, каким образом в раннем эмбриогенезе могли функционировать миофибриллы в отсутствие Са2+-регулирующего белкового компонента саркомеров.

Рис. 7. Варианты организации смешанных миофиламентных пучков в саркоплазме сократительных кардиомиоцитов на продольных срезах желудочкового миокарда человека. А - 6-я неделя эмбриогенеза; левый желудочек. Ув.: 28000. Б -7-я неделя эмбриогенеза; левый желудочек. Ув.: 24000. В - 5-я неделя эмбриогенеза; правый желудочек. Ув.: 32000. Г - 7-я неделя эмбриогенеза; правый желудочек. Ув.: 28000.

Анализ данных литературы о роли и онтогенетических сдвигах тропомиозина, винкулина, десмина и a-актинина позволяет заключить, что указанные белки не имеют каких-либо изомолекулярных форм и представлены уникальными полипептидными последовательностями на любом из этапов развития сердца, однако в кардиогенезе существенным образом изменяются топологические особенности указанных белков. Исследования, проведенные на культивируемых кардиомиоцитах куриных эмбрионов, указали на существенную роль тропомиозина в формировании цитоскелета сократительных клеток, причем до 39й стадии основная масса белка обнаруживалась в цитоплазматической фракции и лишь, затем преобладала в цитоскелете (Muros et al., 1992). Сходная закономерность установлена во внутриклеточном распределении десмина в развивающихся кардиомиоцитах кур (Muros et al., 1990) и сирийских хомячков (Osinska et al., 1993), винкулина - в курином и бычьем миокарде (Pardo et al., 1983). Иммуноцитохимическое и ультраструктурное исследование распределения a-актинина в саркоплазме кардиомиоцитов кур и млекопитающих позволило определить важное значение данного протеина для закрепления концевых саркомеров миофибрилл к адгезивным участкам вставочных дисков и для формирования фокусных контактов (Shimada, 1987), а также для организации тонких (актиновых) миофиламентов в локусах образования Z-дисков (А.Б.Борисов и др., 1989).

Рис. 8. Характер накопления осмиофильного материала в зоне скрепления пучков сократительных филаментов в саркоплазме сократительных кардиомиоцитов левого желудочка сердца человека. А -5-я неделя эмбриогенеза. Ув.: 24000. Б - 6-я неделя эмбриогенеза. Ув.45000. В - 7-я неделя эмбриогенеза. Ув.: 26000.

Изучение свойств нативных препаратов актомиозина эмбрионального сердца быков (Л.Ф.Ефимова и др., 1979) и человека (Н.А.Лебедева, 1974) позволило выявить существование двух форм миозина - "эмбриональной" и "зрелой",- различающихся по своей АТФазной активности и устойчивости к нагреванию. В исследованиях Samuel с сотрудниками (1983), проведенных на изолированных кардиомиоцитах новорожденных, 3-недельных и половозрелых крыс, было выявлено три основных "изофермента" миозина (V1, V2 и V3), причем в зрелом миокарде сократительные клетки были гетерогенны по их содержанию.

В обзоре Epstein (1982) было отмечено, что в онтогенезе млекопитающих наблюдается смена, по меньшей мере, трех форм миозина - эмбриональной, ювинильнои и взрослой.

Рис.9. Динамика плотности упаковки миофибрилл (1) и актиновых полигонов (2) в саркоплазме сократительных кардиомиоцитов левого желудочка в развивающемся сердце человека и крысы.

С помощью непрямого метода иммунофлюоресценции была изучена локализация и онтогенетическая динамика 2 типов миозина (Sanders et al., 1983), обозначенных авторами как предсердный и желудочковый. Показано, в частности, что в миокарде куриных зародышей интенсивность специфической иммунофлюоресценции на "желудочковый" антиген на 20й стадии развития уменьшалась от артериального полюса к венозному. Метка на "предсердный" тип миозина имела обратный градиент, накапливалась в морфологически обособляющихся предсердиях и содержалась в кардиомиоцитах. выстилающих студенистый внеклеточный матрикс атриовентрикулярного канала, артериального ствола и желудочка.

Приведенные данные показывают, что как в отношении количества изоформ миозина, так и в отношении терминологии имеющиеся к настоящему времени сведения во многом противоречивы и мало сопоставимы между собой. В целом, дефинитивный миокард животных с различной частотой сердечных сокращений отличается экспрессией различных изоферментов миозина, уровнем активности АТФ-азы миозина (Hamilton et al., 1991). В обзоре Schuyler et al. (1990) высказывается мнение об экспрессии различных изоформ сократительных белков как о результате уникальной адаптации мышечных тканей с разными физиологическими свойствами.

Рис. 10. Динамика содержания изомолекулярных форм тяжелых цепей миозина в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца человека.

При проведении электрофоретического анализа было установлено, что легкие цепи миозина существенно различаются в предсердиях и желудочках сердца свиньи (Syrovy. 1989). По данным Lohse с сотрудниками (1988), у млекопитающих регуляторные легкие цепи LC2 в желудочках сердца идентичны молекулам из медленной скелетной мышцы и являются, по-видимому, продуктами одного и того же гена. Установлено (м.Д.Принцев, 1973), что наряду с онтогенетическими изменениями изоферментного состава легких цепей миозина (называемого автором легким меромиозином) в миокарде кроликов происходит снижение комплексообразования с холинэстеразой.

Особый интерес исследователей вызвало изучение синтеза тяжелых цепей миозина; это не случайно, так как именно эти молекулы содержат в своем составе участок (зимомер), обладающий АТФазной активностью и определяющий, таким образом, функциональную активность актомиозинового комплекса (Bennett, 1983). Сочетание трансмиссионной электронной микроскопии и гель-электрофореза позволило доказать, что содержание тяжелых цепей миозина в миокарде куриных эмбрионов быстро увеличивается в ходе развития и отчетливо коррелирует со скоростью формирования саркомеров (Lim et al., 1983). Исследования Syrovy (1989) показали, что АТФазная активность миозина желудочков из сердца свиньи практически не изменяется на протяжении постнатального онтогенеза, тогда как препараты предсердий проявляют постепенно возрастающую ферментативную активность.

Рис. 11. Динамика содержания изомолекулярных форм тяжелых цепей миозина в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца крысы.

Онтогенетические изоформные преобразования тяжелых цепей миозина наиболее подробно изучены в миокарде крыс (Buttrick et al.. 1991; Minami et al., 1993) и мышей (Wenderoth et al., 1991; Buckingham et al., 1992); были описаны, в частности, свойства "фетальной" и "зрелой" изомолекулярных форм a-тяжелых цепей миозина (Schuyler et al., 1990). Детальный анализ топологических особенностей синтеза миозиновых молекул в развивающемся миокарде человека представлен в фундаментальном исследовании Wessels с сотрудниками (1991), которые показали, что на эмбриональных этапах a-тяжелые цепи являются доминирующей формой в желудочках и выводном тракте, тогда как a-тяжелые цепи основная форма для предсердий. После разделения предсердий и желудочков с помощью фиброзного кольца в синоатриальном узле экспрессировались обе формы тяжелых цепей - а и в, однако авторы не приводят данных о наличии "фетальной" и "зрелой" изоформ в составе указанных контрактильных белков.

Рис.12. Динамика содержания фетальной и зрелой изомолекулярных форм легких цепей миозина I (%) в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца человека и крысы. 1 - зрелая изоформа в миокарде предсердий; 2 - фетальная изоформа в миокарде желудочков; 3 зрелая изоформа в миокарде желудочков; 4 фетальная изоформа в миокарде предсердий.

По мнению Bandman (1992), наиболее важным фактором, определяющим накопление изоформ контрактильных белков в мышечной ткани (в том числе сердечной), является соотношение процессов транскрипции и альтернативного сплайсинга макромолекул.

Пристальное внимание исследователей было уделено регуляторным аспектам сократительной функции миофибрилл на уровне межмолекулярных взаимодействий (Olson, 1993; Christensen et al., 1993; Barton et al., 1991).

 В комплексных исследованиях, проведенных на различных биологических объектах, была установлена важная регулирующая функция тропонинов по отношению к Са2 + (Godt et al., 1993) и К+ (Marino, 1987), роль М-зависимых АТФаз (Ioshida, 1990). значение молекулярных взаимодействий с цАМФ (О.Г.Гончаров и др., 1987; Worby et al., 1992).

В качестве одного из важнейших факторов, регулирующих активность сократительных структур в миокарде, были изучены креатинфосфокиназные системы кардиомиоцитов (В.А.Сакс и др., 1981; Л.В.Розенштраух и др., 1981; С.Н.Лызлова и др., 1981; Е.И.Чазов, 1981).

Рис. 13. Динамика содержания фетальной и зрелой изомолекулярных форм легких цепей миозина II (%) в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца человека. 1 - фетальная изоформа в миокарде предсердий; 2 - зрелая изоформа в миокарде предсердий; 3 - фетальная изоформа в миокарде желудочков; 4 - зрелая изоформа в миокарде желудочков.

Данные научной литературы, приведенные в настоящем разделе, отражают чрезвычайно сложный характер перестроек сократительного аппарата кардиомиоцитов на этапах онтогенетического развития. Как выяснилось, в основе указанных перестроек заложены молекулярные взаимодействия между различными изоформами сократительных белков, обладающих различными физико-химическими свойствами. При этом, однако, до сих пор не существует отчетливого представления о механизмах распределения изомолекулярных белковых форм в саркоплазме индивидуальных кардиомиоцитов, о закономерностях объединения различных по своей функциональной активности миоцитов в конкретные клеточные комплексы. Отсутствуют также данные о топологических и хронологических особенностях формирования гетерогенитета сократительных клеток по внутриклеточным характеристикам миофибрилл и других сократительных структур.

В наших экспериментах при проведении морфолого-биохимического анализа миокарда обнаружился ряд существенных преобразований сократительных структур кардиомиоцитов, заключающихся как в генерализованном нарастании их объемных характеристик, так и в изменениях белкового спектра развивающихся миофибрилл.

Рис. 14. Динамика содержания фетальной и зрелой изомолекулярных форм легких цепей миозина II (%) в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца крысы. 1 - фетальная изоформа в миокарде предсердий; 2 - зрелая изоформа в миокарде предсердий; 3 - фетальная изоформа в миокарде желудочков; 4 - зрелая изоформа в миокарде желудочков.

В эмбриональном миокарде человека (с 4й по 8-ю неделю пренатального онтогенеза) наблюдается активное формирование миофибриллярного аппарата: саркоплазма насыщается сократительными филаментами, которые перемещаются в субсарколеммальную зону клеток и объединяются в постепенно дифференцирующиеся миофибриллы (рис.1) на поперечных срезах в их составе обнаруживается от полутора до нескольких десятков типичных толстых миозиновых филаментов (диаметром около 15 нм), окруженных 6 тонкими актиновыми нитями (Рис.2).

Пространственная ориентация и упорядоченность примитивных миофибрилл на начальных этапах кардиомиогенеза находятся на невысоком уровне (Рис.3), однако необходимо отметить, что ни в одном из случаев в исследовании не выявлено обособленных миофибрилл с иным соотношением тонких и толстых нитей ни на одной из стадий кардиомиогенеза; по всей видимости, самосборка филаментов предусматривает однозначно определенную геометрическую структуру миофиламентных пучков.

Рис. 15. Динамика содержания изомолекулярных форм актина (%) в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца человека. 1 -"гладкомышечная" изоформа в миокарде предсердий; 2 - "гладкомышечная" изоформа в миокарде желудочков; 3 - "сердечная" изоформа в миокарде предсердий; 4 - "сердечная" изоформа в миокарде желудочков; 5 - "скелетная" изоформа в миокарде предсердий; 6 - "скелетная" изоформа в миокарде желудочков.

Результаты ультраструктурного анализа позволяют также отвергнуть возможность самостоятельного существования упорядоченных миозиновых пучков (без примеси актиновых нитей), однако в эмбриональном и раннем плодном миокарде часто наблюдаются своеобразные актиновые структуры, которые играют, по-видимому, исключительно важное значение в процессе миофибриллогенеза и в формировании сократительной функции в целом.

На поперечных срезах пучков тонких актиновых филаментов (диаметром 5-6 нм) сколько-нибудь фиксированная геометрия их взаимного расположения не определяется; расстояние между отдельными фибриллами также широко варьирует (Рис.4). Кроме того, полиморфными являются профили поперечных сечений актиновых пучков и их размеры. На ультратонких срезах описываемые полигональные фибриллярные структуры распределяются неравномерно в различных кардиомиоцитах: некоторые клетки насыщены ими в степени, превосходящей объем обычных миофибрилл (Рис.5); в большинстве клеток фибрилла-подобные полигоны обнаруживаются лишь в следовых количествах или не определяются вовсе.

Плотность актиновых филаментов на протяжении поперечного профиля одного пучка неодинакова (Рис.6 А-Д); ряд актиновых фибрилл включают уплотнения нитей диаметром около 5 нм, в которых накапливается тонкодисперсный осмиофильный материал. Локусы подобных накоплений наблюдаются, как правило, в суб-сарколеммальной зоне сократительных кардиомиоцитов. По своей электронной плотности уплотнения тонкофиламентных пучков приближаются к материалу зачаточных Z-дисков, иногда они ассоциируются с сарколеммой (Рис.6Б).

Рис. 16. Динамика содержания изомолекулярных форм актина (%) в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца человека. 1 -"гладкомышечная" изоформа в миокарде предсердий; 2 - "гладкомышечная" изоформа в миокарде желудочков; 3 - "сердечная" изоформа в миокарде предсердий; 4 - "сердечная" изоформа в миокарде желудочков; 5 - "скелетная" изоформа в миокарде предсердий; 6 - "скелетная" изоформа в миокарде желудочков.

На продольных ультратонких срезах эмбрионального миокарда в саркоплазме кардиомиоцитов наряду с формирующимися миофибриллами, включающими до 5-6 саркомеров. встречаются также тонкофиламентные или смешанные Фибрилло-подобные комплексы, которые представляют собой пучки плотно сгруппированных актиновых и миозиновых нитей длиной около 1 мкм (Рис.7), в ряде случаев скрепленных осмиофильным Z-подобным материалом (так называемыми Z-тельцами) (Рис.8). По своему принципу строения они напоминают сократительные структуры, описанные в научной литературе как "стресс"-фибриллы немышечных клеток (в частности, фибробластов), и соответствуют, видимо, фибрилло-подобным полигонам, определяемым нами на поперечных срезах кардиомиоцитов.

Наряду с такими I-Z-I-подобными комплексами в саркоплазме кардиомиоцитов определяются также пучки филаментов, содержаще смесь тонких и толстых нитей (вне обычных миофибрилл), однако в этом случае они представлены двумя вариантами взаимного расположения: 1) полтора саркомеро-подобных сегмента (ZI-AIZ-IA-комплекс); 2) половина сегмента (Z-1-А-комплекс). Обязательным условием существования таких комплексов является их фиксация к адгезивному участку вставочного диска, тогда как актиновые I-Z-1комплексы располагаются в клеточном объеме свободно и ориентируются параллельно длинной оси кардиомиоцита; в большинстве случаев "стресс"-подобные структуры находятся в непосредственной близости к формирующимся миофибриллам по всей их длине. Аналогичная закономерность прослеживается и на поперечных срезах сократительных клеток; кроме того, во внутренней зоне формирующихся миофибрилл часто можно обнаружить своеобразные полости, не заполненные стандартными гексагональными ансамблями толстых и тонких филаментов. Иногда здесь определяются лишь остатки актиновых нитей (Рис.6Д).

Рис. 17. Динамика содержания "скелетной" изомолекулярной формы тропонина Т (%) в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца человека и крыс.

Важным обстоятельством, характеризующим возможную роль актиновых фибрилл, является онтогенетическая динамика соотношения их объемных характеристик с уровнем содержания миофибрилл в сократительной клетке. Так, в раннем эмбриональном периоде развития человека (с 4й по 6-ю неделю пренатального онтогенеза) на фоне активного нарастания плотности упаковки миофибрилл (с 0,036 до 0,146 мкм³/мкм³) содержание актиновых I-Z-I-комплексов превосходит величины миофибриллярного аппарата желудочковых кардиомиоцитов. однако на протяжении 7й недели плотность упаковки актиновых полигонов резко уменьшается (от 0,181 мкм³/мкм³ до 0,042 мкм³ 7мкм³) и к началу 4-го месяца внутриутробного развития составляет следовые количества в саркоплазме кардиомиоцитов (Рис.9).

Рис. 18. Динамика содержания "сердечной" изомолекулярной формы тропонина Т (%) в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца человека и крыс.

Редукция количества актиновых фибрилло-подобных комплексов сопровождается стабилизацией плотности упаковки миофибрилл; после 12й недели плодного развития накопление миофибриллярной массы активно ускоряется, однако это не сопровождается сколько-нибудь значимым увеличением содержания актиновых полигонов - оно остается на фоновом уровне на протяжении пренатального онтогенеза, а в миокарде З6-недельных плодов человека указанные структуры не обнаруживаются вовсе. Стереологическое измерение абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл показало (Табл.1), что первый период активного накопления миофибриллярной массы обусловлен нарастанием количества миофибрилл за счет их новообразования и удлинения (в эмбриональном периоде активно увеличивается их суммарная площадь в клетке); при этом содержание актиновых полигонов высоко. Второй период нарастания плотности упаковки миофибрилл обусловлен утолщением уже имеющихся пучков (но не их синтезом dе novo) на фоне стабилизации абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл и невысокого содержания актиновых фибрилло-подобных структур. Аналогичная динамика накопления миофибрилл и актиновых фибрилл (полигонов) и соотношение между ними обнаруживаются при изучении желудочкового миокарда крыс (Рис.9; Табл.2). При анализе описанных структур становится очевидным, что сократительный аппарат развивающихся кардиомиоцитов представлен полиморфными фибриллярными образованиями, имеющими непосредственное отношение к процессам миофибриллогенеза.

Таблица 1 Динамика значений абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл желудочковых кардиомиоцитов в пренатальном онтогенезе человека (мкм^-1).

Логично предположить, что смешанные (актиново-миозиновые) комплексы и актиновые полигоны имеют неодинаковое значение в механизмах формирования миофибрилл. Вероятна, что варианты морфологии смешанных пучков отражают самые начальные этапы новообразования миофибрилл, тогда как характер онтогенетических сдвигов, локализации и ориентации I-Z-I-подобных полигонов в саркоплазме указывает на их возможное участие в инициации саркомерогенеза (при этом, разумеется, нельзя исключить самостоятельную сократительную активность "стресс"-подобных фибриллярных структур, характерную для некоторых немышечных клеток).

Рис. 19. Динамика содержания "скелетной" изомолекулярной формы тропонина I (%) в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца человека и крыс.

При использовании лишь электронно-микроскопического исследования весьма сложно преодолеть рамки указанных предположений и перейти к более определенной характеристике биологического значения гетеро-морфкых сократительных структур; проблема гетерогенности сократительного аппарата кардиомиоцита находится в плоскости макромолекулярных взаимодействий между различными белковыми компонентами миофибрилл и I-Z-I-подобных полигонов. В соответствии с этим мы провели электрофоретическое разделение главных (мажорных) сократительных белков из миокарда человека (с 6й по 40-ю неделю пренатального онтогенеза) и крыс (с 14х суток эмбриогенеза до зрелого возраста).

Таблица 2 Динамика значений абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл желудочковых кардиомиоцитов в пренатальном, онтогенезе крыс (мкм^-1).

Результаты исследований показали, что относительное содержание А и b-тяжелых цепей миозина в составе актомиозина желудочковых кардиомиоцитов с 6й по 12-ю неделю внутриутробного развития составляет около 40% от всех сократительных белков (Рис.10). На электрофореграммах полоса указанных белков располагается в области с молекулярной массой 220 KD; по своей относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) регистрируемый белок соответствует фракции Vt. Начиная с 4-го месяца плодного периода происходит активное снижение уровня указанной фракции (от 40% на 14й неделе до 20% на 28й неделе), однако при этом в зоне А и b-тяжелых цепей миозина появляются дополнитель ные полосы, соответствующие описанным в литературе V2- и V3-изоформам.

Рис. 20. Динамика содержания "сердечной" изомолекулярной формы тропонина I (%) в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца человека и крыс.

Относительное содержание фракции V2 быстро нарастает и достигает максимума на 20й неделе развития; затем происходит эффективное снижение доли этой изоформы тяжелых миозиновых цепей (к 28й неделе указанные белки составляют лишь 4% от всех сократительных протеинов и остаются на этом уровне до конца внутриутробного развития). Уровень фракции V3 повышается вплоть до 28й недели плодного периода развития, однако в последующем стабилизируется на уровне 24% (Рис.11). Суммарный уровень всех трех изоформ й и b-тяжелых цепей миозина составляет около 40% от сократительных белков на всех исследуемых этапах пренатального онтогенеза.

Аналогичный характер сдвигов изомолекулярного состава А и b-тяжелых цепей миозина обнаружен при биохимическом анализе желудочковых кардиомиоцитов крыс; при этом соотношение фракций Vx , Vg и V3 в миокарде 5-дневных животных достигает уровня, характер ного для зрелых крыс, а также для поздних плодов человека (Рис.11).

Анализ миокарда предсердий у эмбрионов и ранних плодов человека (до 12й недели пренатального развития) не обнаруживает существенных отличий уровня тяжелых миозиновых цепей от значений в желудочках, однако в последующем наблюдаются 3 важных обстоятельства, определяющих специфику миокарда предсердий: 1) изоформа V1 после 16й недели плодного периода лишь незначительно снижается по своему относительному содержанию и к концу внутриутробной жизни остается на высоком уровне (около 31%); 2) изоформа V3 появляется на электрофореграммах лишь после 20й недели пренатального развития и по относительному содержанию значительно уступает фракции V1; 3) изоформа V1 не выявляется при электрофоретическом разделении предсердных сократительных белков ни на одной из изученных стадий онтогенеза (Рис.10).

Рис. 21. Динамика содержания изомолекулярных форм тропонина С (%) в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца человека и крысы. 1 - "скелетная" изоформа в миокарде желудочков; 2 - "сердечная" изоформа в миокарде желудочков; 3 - "скелетная" изоформа в миокарде предсердий.

На рисунке 11 представлены результаты исследования миокарда предсердий у крыс, обнаружившие принципиально сходный характер сдвигов по сравнению с таковыми у человека. По всей видимости, полученные результаты не имеют выраженной видовой специфики, но отражают существенные различия в изоформных преобразованиях тяжелых цепей миозина на этапах онтогенеза, наблюдаемых в предсердиях и желудочках.

Электрофоретическое выявление легких цепей миозина в эмбриональном миокарде человека показывает наличие двух белков в протеиновом спектре сократительных структур - легкой цепи I (Mr=25,6 kD) и легкой цепи II (Mr=17,8 kD), каждая из которых представлена одной изоформой, описанной в литературе как "фетальная". В предсердиях и желудочках вплоть до 12й недели пренатального онтогенеза соотношение легких цепей I и II не изменяется, однако в последующем происходят существенные перестройки в структуре легких цепей миозина. В Желудочковых кардиомиоцитах в период с 12й по 32-ю неделю плодного развития фракция легких цепей I состоит из двух изоформных белков, различающихся по относительной электрофоретической подвижности, причем "фетальная" изоформа закономерно уступает свое место "зрелой" изоформе (Рис.12). Аналогично изменяются соответствующие изоформы легких миозиновых цепей II (Рис.13), что приводит к полному замещению "фетальных" изоформ "зрелыми" с сохранением соотношения между 1-й и 11-й легкими цепями, установившимися в начальный период кардиогенеза.

Рис.22. Динамика содержания актинина (%) в развивающемся миокарде желудочков и предсердий сердца человека и крысы. Рис. 23. Характер распределения АТФазной активности миофибрилл в миокарде левого желудочка сердца человека на 40й неделе внутриутробного развития. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок.15, об.100.

В предсердиях обнаруживаются иные преобразования белкового спектра легких цепей миозина, заключающиеся в постепенном нарастании уровня "фетальной" изоформы легких молекул 1-го типа с молекулярной массой 17,8 kD, тогда как "зрелая" изоформа на электрофореграммах не выявляется (Рис.12). Изоформы легких миозиновых цепей II перестраиваются по схеме, характерной для желудочковых кардиомиоцитов (Рис.13), однако они в значительной мере вытесняются "фетальными" молекулами легких цепей I (в конечном итоге их относительное содержание не превышает 1%).

В миокарде крыс (Рис.12; 14) обнаруживаются принципиально сходные изоформные перестройки в составе легких цепей миозина; дефинитивное соотношение между отдельными белками данного класса устанавливается к концу 1-го месяца перинатального развития. Таким образом, наряду с отсутствием видовой специфики в распределении легких цепей миозина обнаруживается достаточно отчетливая специфика изоформ данных сократительных белков по отношению к предсердиям и желудочкам: в миокарде поздних плодов человека и 30-дневных крысят желудочковые миофибриллы содержат только "зрелые" формы легких цепей I и II в соотношении, близком к 1. тогда как в предсердиях преобладают "фетальные" изоформы легких миозиновых цепей I.

Рис. 23. Характер распределения АТФазной активности миофибрилл в миокарде левого желудочка сердца человека на 40й неделе внутриутробного развития. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок.15, об.100.

Изучение онтогенетических сдвигов изомолекулярных форм a-актина в составе сократительных структур желудочковых кардиомиоцитов человека и крысы обнаруживает сопоставимые тенденции. Так, в эмбриональном миокарде электрофоретически обнаруживаются две изоформы a-актина, которые по молекулярной массе и относительной форетической подвижности соответствуют так называемым "скелетному" и "гладкомышечному" типам. На протяжении с 6-й по 14-ю неделю пренатального онтогенеза человека уровень a-скелетного актина составляет в среднем 18-19% от всех сократительных белков клетки, однако в течение 14-32й недель развития синтез указанной изоформы резко снижается и достигает нулевого уровня (Рис.15). Это снижение происходит на фоне пропорционального нарастания экспрессии а-сердечной формы фибриллярного актина, которая к концу внутриутробного развития достигает уровня 18% среди сократительных протеинов. Подобная, но более стремительная динамика взаимной смены скелетной и сердечной изомолекулярных форм a-актина наблюдается в желудочковом миокарде крыс.

Динамика содержания гладкомышечной формы a-актина выявила наивысший уровень белка в эмбриональном миокарде человека (12-13%); после 8й недели развития отмечается выраженное снижение доли указанной изоформы (Рис.15); в течение 14-32й недель плодного периода содержание гладкомышечной изомолекулярной формы стабилизируется на уровне 6-8% от всех сократительных протеинов, а затем вновь снижается до нулевых значений в миокарде 40-недельных плодов человека.

Рис. 24. Одиночная сократительная клетка с интенсивной равномерной АТФазной активностью миофибрилл. Миокард левого желудочка сердца человека на 40й неделе внутриутробного развития. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок.15, об.100.

В миокарде желудочков в онтогенезе крыс динамика изменений гладкомышечного a-актина имеет двухфазный характер активное нарастание экспрессии указанной изоформы с 14-х по 20-е сутки эмбриогенеза сменяется столь же активной редукцией уровня белка (Рис.16). В итоге этих сдвигов в миокарде 10-суточных крысят электрофоретически не удается идентифицировать гладкомьшечную форму a-актина.

В миокарде предсердий человека и крыс обнаруживаются 2 важных обстоятельства, определяющих специфику онтогенетических сдвигов в изомолекулярном спектре a-актина: 1) к концу плодного периода у человека, а также в зрелом миокарде крыс стабильно обнаруживается скелетная изоформа a-актина в количествах, сопоставимых с уровнем сердечной изоформы; 2) относительное содержание гладкомышечной изомолекулярной формы a-актина значительно ниже, чем в миокарде желудочков, а период экспрессии указанной изоформы - существенно короче (Рис.15; 16).

Рис. 25. Четкая граница между гетерогенно окрашенными сократительными кардиомиоцитами в миокарде левого желудочка сердца крысы на 30Е сутки постнатального онтогенеза. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок.15, об.90.

Характерно, что на фоне выраженной динамики скелетной и сердечной изоформ a-актина их суммарное удельное содержание в составе саркомеров остается стабильным на всех изученных этапах онтогенеза человека и крысы как в предсердиях, так и в желудочках. Это подтверждает данные ультраструктурного анализа о том, что миофибриллы независимо от степени своей дифференцировки и объемных показателей миофибриллярного аппарата строятся по единому геометрическому плану (гексагональные комплексы тонких и толстых миофиламентов с фиксированным расстоянием между ними). Напротив, несаркомерные изомолекулы a-актина с молекулярной массой 42,8 И) (гладкомышечного типа) по своему содержании отчетливо коррелируют с плотностью упаковки актиновых фибрилло-подобных полигонов, определяемой стереологически на электроннограммах. Учитывая эти данные, представляется возможным исключить участие a-скелетного и a-сердечного актина в формировании актиновых I-Z-I-комплексов. Единственным реальным претендентом на эту роль (принимая во внимание отсутствие дополнительных изоформ фибриллярного a-актина) является так называемая "гладкомышечная" изомолекулярная форма. При этом необходимо отметить, что далеко не все гладкомышечные актиновые фибриллы включаются в состав I-Z-I-комплексов; в саркоплазме кардиомиоцита существуют и другие актин-содержащие структуры, не относящиеся к сократительным.

Рис. 26. Участки миокарда зрелой крысы, фиксированного в систоле. А - правый желудочек. Б - левый желудочек. Криостатный срез. Интенсивная АТФазная активность в сокращенных волокнах; умеренная - в расслабленных. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок.10, об.90.

Одним из мажорных белковых компонентов миофибрилл является группа тропонинов - белков, ответственных за связывание ионов кальция и регуляцию АТФазной активности миофибрилл в процессе деполяризации сарколеммы при сердечном сокращении. В зависимости от физико-химических свойств выделяют тропонин Т (Мr=38,5 kD), тропонин I Mr=24 kD) и тропонин С (Mr=31,5 kD). Для каждого из указанных протеинов характерны две изомолекулярные формы - скелетная и сердечная. При анализе их распределения в миокарде желудочков и предсердий на этапах онтогенеза выявляются важные специфические особенности, определяющие функциональный профиль исследуемых сократительных структур.

Рис. 27. Миокард левого желудочка зрелой крысы, фиксированного в систоле. Интенсивная АТФазная активность в расслабленных волокнах: умеренная - в сокращенных. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman в инкубационной среде с рН 5,8. Ок.15, об.90.

Скелетная изомолекулярная форма тропонина Т не только преобладает в раннем кардиомиогенезе, но и является единственной как в желудочках, так и в предсердиях, составляя 4-5% от всех сократительных белков (Рис.17). Альтернативная экспрессия сердечной изоформы тропонина Т обнаруживается лишь после 16й недели плодного развития человека и на 18-е сутки эмбриогенеза крыс. С этого периода сердечная изоформа тропонина Т начинает активно вытеснять скелетную изоформу: к концу пренатального онтогенеза в желудочковом миокарде человека, а также в соответствующей зоне у 5-дневных крысят . уровень сердечного тропонина Т 4-кратно превышает содержание скелетного тропонина Т (Рис.18).

Рис. 28. Миокард, левого желудочка крысы на 30Е сутки жизни, фиксированного в систоле. Гистохимическая реакция на АТФазу миозина по Padykula, Herman в инкубационной среде с 45 мМ Са при рН 7,4. Ок.15, об.90.

В отличие от желудочков, результаты изучения предсердий выявляют лишь незначительную редукцию скелетных изомолекулярных форм тропонина Т в онтогенезе человека и крысы (Рис.17); соответственно содержание сердечного тропонина Т не превышает 1,5% от уровня сократительных белков, несмотря на то, что хронологически динамики экспрессии сердечной изоформы в предсердиях и желудочках совпадают (Рис.18).

Идентификация на электрофореграммах изомолекулярных форм тропонина I с последующим анализом их онтогенетической динамики позволяет сделать заключение о принципиальном соответствии их синтеза с характеристиками тропонина Т. Характер вытеснения скелетной изоформы тропонина I сердечной формой в желудочках, существенное преобладание скелетной изоформы в предсердиях на всех исследуемых этапах онтогенеза у человека и крыс, а также хронологическое сопряжение сдвигов уровней изомолекулярных форм тропонинов Т и I отчетливо свидетельствуют о явлении парной ко-экспрессии рассматриваемых белков (Рис.19; 20). Вероятно, что каждая из пар протеинов (в скелетной или сердечной конфигурациях) является продуктом одного гена с последующим альтернативным сплайсингом, в результате которого образуется две полипептидных последовательности с молекулярными массами 24 kD (тропонин I) и 38,5 kD (тропонин Т). При этом экспрессия "скелетного" и "сердечного" генов подчиняется обратной пропорциональной зависимости с сохранением постоянного соотношения между уровнями тропонина I и тропонина Т.

Рис. 29. Миокард левого желудочка крысы на 60Е сутки жизни. Фаза систолы. Равномерное распределение активности миозиновой АТФ-азы. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman в инкубационной среде с 45 мМ Са при рН 5,8. Ок.15, 06.90.

Анализ динамики содержания тропонина С показывает, что на ранних этапах кардиомиогенеза в желудочковых кардиомиоцитах существует непродолжительный период (6-7-я неделя эмбриогенеза человека; 14-20-е сутки эмбриогенеза крыс), когда на электрофореграммах определяется скелетная изоформа исследуемого белка (Рис.21). При этом в миокарде желудочков происходит выраженное нарастание уровня сердечного тропонина С; в начальном постэмбриональном периоде отмечается некоторая стабилизация экспрессии протеина, сменяющаяся новым периодом активного нарастания содержания сердечной изоформы. Дефинитивный уровень в миокарде желудочков достигается на 28й неделе плодного периода развития у человека и к концу 1-го месяца жизни крыс.

В миокарде предсердий на протяжении эмбрионального развития изученных объектов содержание скелетной формы тропонина С не снижается (как это характерно для желудочков), а в последующем даже активно повышается (в 2 и более раз) по сравнению с эмбриональным уровнем (Рис.21). Наблюдаемое повышение носит импульсный характер и отмечается с 8-й по 10-ю неделю пренатального онтогенеза человека и с 1-го по 5-й день жизни у крыс. Характерно, что наиболее значимые перестройки изомолекулярного спектра этого белка в желудочках хронологически совпадают с импульсным подъемом уровня тропонина С в предсердиях; интерес представляет и еще одна особенность: на эдектрофореграммах сократительных белков предсердий ни на одной из исследуемых онтогенетических стадий в миокарде человека и крыс не удается идентифицировать сердечную изоформу тропонина С (Рис.21). Эти обстоятельства позволяют выделить три важных белково-специфических особенности тропонина С: 1) экспрессия указанного белка не вступает в ко-экспрессивные либо конкурентные отношения с синтезом тропонинов I и Т; 2) уровень тропонина С не имеет константных значений в составе сократительных структур предсердных и желудочковых кардиомиоцитов; 3) скелетная изомолекулярная изоформа тропонина С функционирует лишь на начальных этапах желудочкового кардиомиогенеза, а в предсердиях является единственной на всех онтогенетических этапах.

Рис. 30. Гомогенное распределение АТФазной активности миозина в компактном миокарде левого желудочка человека на 8й неделе внутриутробного развития. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок.15, об.40.

Учитывая сведения о внутриклеточном распределении а-актинина (основного белка 2материала и адгезивных участков вставочных дисков), а также данные о присутствии данного протеина в немышечных сократительных системах (в частности, "стресс"-фибриллах некоторых соединительнотканных и эпителиальных клеток), представляет особый интерес изучение онтогенетической динамики а-актинина в миокарде желудочков и предсердий у исследуемых объектов. Электрофоретическое разделение сократительных белков показывает, что в течение 6-10й недель пренатального онтогенеза человека, а также на протяжении всего эмбрионального кардиомиогенеза у крыс относительное содержание a-актинина составляет 16-18% от всех сократительных белков. В дальнейшем наблюдается постепенное (в миокарде человека) или резкое (у крыс) снижение содержания уровня бежа до уровня 7-8% и остается стабильным на последующих онтогенетических стадиях (Рис.22).

В миокарде предсердий на ранних эмбриональных этапах удельная доля а-актинина составляет 12-14%, причем уже к концу эмбрионального кардиогенеза наблюдается интенсивное снижение уровня данного белка до величин, характерных для желудочковых кардиомиоцитов (Рис.22).

Рис. 31. Характер распределения АТФазной активности миозина в миокарде левого желудочка сердца человека на 14й неделе внутриутробного развития. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок.15, об.100.

Таким образом, в кардиомиогенезе изученных объектов как в желудочках, так и в предсердиях определяются периоды, различавшиеся по уровню а-актинина в составе сократительных структур. Существует, по крайней мере, две предположительных причины повышенного относительного содержания а-актинина в составе сократительных белков на ранних этапах онтогенеза. Первая из них связана с активным расходованием бежа не только для закрепления актиновых филаментов соседних саркомеров в процессе миофибриллогенеза, но и для участия в формировании ориентированных актин-содержащих полигонов в саркоплазме кардиомиоцитов. Вторая причина заключается в постоянно высоких внутриклеточных концентрациях свободного а-актинина, не связанного с сократительными структурами, а лишь транспортаруемого к ним.

В этих условиях необходимо указать ряд предпосылок, делающих вторую причину маловероятной: 1) период полураспада a-актинина составляет слишком большую величину (3-4 дня) для того, чтобы вызвать потребность в значительных количествах транспортных форм белка; 2) физико-химические свойства a-актинина позволяют ему включаться в состав миофибрилл в течение 4-5 секунд после микроинъекции в клетку (Imanaka-Ioshida et al., 1993); 3) избыточное количество a-актинина по отношению к стабильному содержанию данного белка (7-8%) в зрелых миофибриллах (без примеси других сократительных структур в саркоплазме кардиомиоцитов) отчетливо коррелирует с плотностью упаковки актиновых I-Z-I-комплексов как количественно, так и хронологически. Указанные предпосылки с большой степенью достоверности позволяют заключить, что описанные на электроннограммах локусы осмиофильных уплотнений актин-содержащих полигонов обусловлены включением a-актинина.

Рис. 32. Гетерогенная гистохимическая реакция на АТФазу миозина в миокарде правого желудочка сердца человека на 16-й неделе внутриутробного развития. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок.15, 06.90.

Принципиальное значение для характеристики функциональной активности миофибрилл имеет изучение АТФазной активности актомиозиновых комплексов. Известно, что зимомерные АТФазные участки входят в состав й"и a-тяжелых цепей миозина (Bennett, 1983); как мы уже показали, каждая из них в плодном периоде развития может быть представлена тремя изомолекулярными формами (V₁ V₂ и V₃). Для анализа функциональной активности указанных изоформ мы изучили интенсивность АТФазной реакции в изолированных препаратах V₁. V2И V3молекул, полученных из миокарда человека и крыс на различных этапах онтогенеза. В результате экспериментов обнаружилось, что АТФазная активность V₁-формы А и b-тяжелых цепей миозина составляет в среднем 23,6 мкм Р; на 1 мг белка за 1 мин; V₂-формы - 14,2 мкм/мг/мин; V₃-формы - 58,5 мкм/мг/мин. Характерно, что установленные значения не различаются существенно в миокарде крысы и человека, а также не изменяются на протяжении онтогенеза. Это позволяет сделать два заключения: 1) в основе развития сократительной активности миофибрилл находятся перестройки в соотношении изомолекулярных форм тяжелых миозиновых цепей, но не изменения их биохимических свойств; 2) указанные изоформы не имеют видовой специфичности и являются продуктами соответствующих гомологичных генов.

Рис. 33. Постепенный непрерывный градиент АТФазной активности миофибрилл на протяжении саркоплазмы. Миокард правого желудочка новорожденной крысы. Гистохими ческая реакция по Padykula, Herman. Ок.15, об. 100.

Исходя из полученных результатов, принципиальное значение приобретает вопрос о том, каким образом распределены различные изоформные молекулы в составе миофибрилл одной клетки и в клеточных комплексах, а также в различных отделах сердца и зонах сердечной стенки.

Гистохимическое исследование, проведенное на тканевых срезах миокарда поздних плодов человека (32-40 недель) и постнатальных сердец крыс, указало на существование выраженной гетерогенности сократительных клеток по Са2 -активируемой АТФазной активности миофибрилл. При этом выявляется ряд закономерностей в распределении гистохимической метки.

Во-первых, в пределах саркоплазмы одного кардиомиоцита миофибриллы не отличаются друг от друга по интенсивности окрашивания (Рис.23) - распределение АТФазной активности равномерно как в составе интенсивно окрашивающихся клеток, так и в умеренно окрашенных кардиомиоцитах. Вполне вероятно, что этот факт отражает однородность изомолекулярного состава миофибрилл и их функциональной активности в рамках регуляции одного генома.

Рис. 34. Мозаичное распределение АТФазной активности в саркоплазме желудочкового кардиомиоцита новорожденной крысы. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок.15, об.100.

Во-вторых, сердечные миоциты существенным образом отличаются друг от друга по интенсивности гистохимического окрашивания и объединяются в варьирующие по размерам клеточные группы, включающие от 10 до 80 мышечных клеток. В ряде случаев обнаруживаются одиночно расположенные кардиомиоциты в составе мышечного волокна, имеющие ярко выраженный гетерогенный характер интенсивности гистохимической метки по АТФазной активности миофибрилл (Рис.24).

В-третьих, граница гетерогенного окрашивания соседних сократительных клеток в составе мышечного волокна всегда достаточно отчетлива и топологически соответствует вставочному диску (Рис.25), но ни в одном из случаев не обнаруживается в центральных участках кардиомиоцитов.

Рис. 35. Характер межклеточных границ в зоне вставочных дисков в миокарде левого желудочка. А сердце человека на 16й неделе плодного периода (Ок.15, об.90); Б - сердце новорожденной крысы (Ок.15, об.40). Гистохимическая реакция на миозиновую АТФазу по Padykula, Herman.

В-четвертых, соседние мышечные волокна в составе миокарда, обработанного в фазе систолы, находятся как в сокращенном, так и в релаксированном состоянии, причем интенсивная метка АТФ-азы миофибрилл всегда накапливается в контрастирующем волокне, а умеренная или низкая - в расслабленном (Рис.26А). иногда выпадающее из сокращения мышечное волокно отчетливо определяется по характерному извилистому ходу (Рис.26Б).

В-пятых, интенсивность гистохимической метки, определяемой цитоспектрофотометрически над различными гетерогенными по окрашиваемости клетками (ширина тубуса 48 мкм2), соотносится следующим образом: над "активными" (темными) - 0,54±0,08 единиц оптической плотности (ЕОП); над менее "активными" (светлыми) -0,21±0,04 ЕОП. Весьма интересным и важным представляется то обстоятельство, что соотношение между указанными цитоспектрофотометрическими значениями практически не отличается от соотношения между величинами, полученными при дифференцированном биохимическом определении активностей Са2+-активируемых АТФаз в изолированных препаратах V3- и V1фракций тяжелых цепей миозина. Это свидетельствует о том, что на изученных тканевых срезах миокарда поздних плодов человека (32-40 недель) и постнатальных сердец крыс наблюдаемые нами распределения гетерогенных по своей активности сократительных клеток обусловлены различиями в изомолекулярном спектре тяжелых цепей миозина, несущих в своем составе зимомерные участки с АТФазной активностью.

Рис. 36. Резкая граница между кардиомиоцитами с низкой АТФазной активностью миофибрилл и окружающими сократительными клетками в желудочковом миокарде. А - левый желудочек сердца человека на 24й неделе плодного периода; Б - правый желудочек сердца новорожденной крысы. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок. 15, 06.90.

Анализ перечисленных закономерностей в распределении гистохимической метки вызывает к необходимости постановку ряда вопросов, связанных с регуляторными механизмами, ответственными за обеспечение функциональной активности миофибрилл. При проведении гистохимической реакции в инкубационной среде с низкими значениями рН (от 6,4 до 5,8) на срезах миокарда, фиксированных в систолическом состоянии, обнаруживается интенсивное накопление метки в волокнах, имеющих извилистый ход и находящихся в релаксированном состоянии (Рис.27). Эта ситуация диаметрально противоположным образом отличается от распределения гистохимически определяемой активности АТФ-азы при физиологических значениях рН (Рис.26Б) и свидетельствует о том, что в условиях ацидоза АТФазная активность V1фракции тяжелых цепей миозина в составе расслабленных миофибрилл заметно активируется, тогда как функциональная активность V3фракции миозина (миофибриллы сокращенных кардиомиоцитов) заметно угнетена.

Учитывая регулирующие свойства молекул тропонина I и различную  устойчивость скелетной и сердечной изоформ указанного белка к ацидозу, становится очевидным, что в составе миофибрилл V₁-форма тяжелых миозиновых цепей ассоциирована со скелетной изоформой тропонина I (это, собственно, и обусловливает повышенную устойчивость таких актомиозиновых комплексов к ацидозу). При этом V₃-форма тяжелых цепей миозина в миофибриллах ассоциируется с сердечной изоформой тропонина I (неустойчивой к ацидозу), что приводит к заметному угнетению функциональной (АТФазной) активности сокращающихся миофибрилл. Экстраполяция полученных данных на конкретную физиологическую ситуацию позволяет предположить, что несокращающиеся в обычных условиях кардиомиоциты, обладающие сопряжением V₁-формы миозина со скелетной изоформой тропонина I в составе миофибрилл, являются тем функциональным резервом, который включается при ацидотических состояниях в механизмы компенсации сократительной функции миокарда.

Рис. 37. Гетерогенитет клеточного состава желудочкового миокарда по содержанию изоформ тяжелых миозиновых цепей. Миокард левого желудочка человека на 28-й неделе плодного периода. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок.15, об.100.

Гистохимический анализ Са²⁺-связывающей функции миофибрилл показывает, что при повышенной концентрации кальциевых ионов в инкубационной среде характер распределения АТФазной активности миофибрилл не отличается существенным образом от описанного для физиологических концентраций Са²⁺ (Рис.28): в систолической фазе сокращенные кардиомиоциты несут в своем составе равномерную интенсивную гистохимическую метку (от 0,51 до 0,58 ЕОП); расслабленные клетки имеют невысокий уровень АТФазной активности (от 0,18 до 0,22 ЕОП). Этот результат свидетельствует о том, что миофибриллы в составе "активных" кардиомиоцитов обладают устойчивостью к повышенным концентрациям Са²⁺.

Создание в инкубационной среде с высоким уровнем Са²⁺ кислотных значений рН приводит к тому, что на тканевых срезах миокарда, фиксированного в состоянии систолы, происходит угнетение АТФазной активности V₃-фракции миозина в составе сокращенных клеток, однако (вопреки ожиданиям) мы не обнаружили кислотной активации АТФазной реакции в "резервных" кардиомиоцитах, несущих в своем составе V₁-фракцию тяжелых миозиновых цепей. Срезы миокарда приобретают вид гомогенно окрашенных участков с низкой интенсивностью) гистохимической метки, на которых V₂ и V₃-содержащие сократительные клетки не   дифференцируются    (Рис.29).

Рис. 38. Мозаичное содержание гистохимической метки АТФ-азы миозина в цитоплазме кардиомиоцитов правого желудочка сердца крысы на 5-е сутки постнатального онтогенеза. Реакция по Padykula, Herman. Ок.15, об.90.

 Итак, повышение уровня ионов Са²⁺ в инкубационной среде предотвращает активацию АТФ-азы в составе "резервных" клеток, обусловленную кислыми значениями рН, что свидетельствует о низкой устойчивости их миофибрилл к повышению концентрации кальциевых ионов.

Описанные закономерности гистохимического распределения АТФазной активности миофибрилл отражают зрелый уровень сократительного аппарата, предусматривающего существование двух изоформных белковых комплексов в составе миофибрилл. На ранних этапах онтогенеза сократительный миокард представлен гомогенной совокупностью кардиомиоцитов (Рис.30). Начиная с 12й недели плодного развития человека и с 20х суток эмбриогенеза крыс обнаруживаются единичные клетки, обладающие повышенной активностью миофибриллярной АТФ-азы. На рисунке 31 отчетливо видно, что гистохимическая метка АТФ-азы распределяется неравномерно в составе миофибрилл, что отражает их неоднородность по включению Vt и V3изомолекулярных форм в актомиозиновые комплексы. Очевидно, что в этот период указанные белковые изоформы способны сосуществовать в одной сократительной клетке и даже в составе одной миофибриллы. В ряде случаев описываемые клетки обнаруживаются в непосредственной близости к кардиомиоцитам, обладающим гомогенной интенсивно окрашенной саркоплазмой (Рис.32).

Рис. 39. Распределение АТФазной активности миозина в миокарде левого желудочка сердца крысы на 7-е сутки постнатального онтогенеза. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок.15, об.40.

Внутриклеточное распределение АТФазной активности представлено, в основном, двумя вариантами: 1) непрерывный, но выраженный градиент гистохимической метки от одного интеркалярного диска к другому (Рис.33); 2) мозаичное распределение, включающее чередующиеся "светлые" и "темные" участки саркоплазмы (Рис.34). Во втором из указанных вариантов в клетках миокарда, фиксированного в состоянии систолы, часто определяются признаки релаксации, свидетельствующие о выпадении определенных кардиомиоцит"ов из координированного сокращения. На рисунке 34 видно, что такие клетки находятся в составе мышечного волокна и формируют с соседними миоцитами полноценные вставочные -диски. По-видимому, описываемые кардиомиоциты. претерпевая выраженные изоформные белковые преобразования, вынуждены временно выйти из сопряженного сокращения, однако при этом они сохраняют способность к передаче мембранного электрофизиологического потенциала.

Рис. 40. Состояние АТФазной активности расслабленных и сокращенных кардиомиоцитов в миокарде правого предсердия человека на 28й неделе пренатального онтогенеза. Гистохимическая реакция по Padykula, Herman. Ок.15, об.100.

Одной из характерных особенностей распределения гистохимической метки Са²⁺-активируемой АТФ-азы миофибрилл является то, что граница между соседними гетероморфными клетками всегда топологически соответствует зоне вставочного диска, несмотря на активное протекание белковых перестроек в одной из них (Рис.35).

В период с 20-й по 28-ю неделю плодного периода в сердце человека и у новорожденных крыс на продольных срезах миокарда желудочков обнаруживается большое количество клеток с минимальной активностью миофибриллярной АТФ-азы, которые располагаются одиночно или пучками по 3-4 клетки (Рис.36), в то время как в предсердиях подобные кардиомиоциты не определяются. В каждом из случаев такие клетки имеют резкую границу с "умеренно активными" или (реже) "высокоактивными" клетками, цитоспектрофотометрически интенсивность гистохимической метки над цитоплазмой указанных кардиомиоцитов составляет 0,07-0,09 единиц оптической плотности. Принимая во внимание данные биохимического анализа АТФазной активности изолированных препаратов V₁-. V₂- и V₃-изоформ тяжелых цепей миозина, становится очевидным, что обнаруженные участки минимальной гистохимической метки соответствуют V₂-изомолекулярной форме в составе миофибрилл. Это подтверждается также представленными ранее данными электрофоретического разделения изоформ белкового спектра нативного актомиозина: а) в исследуемый период удельное содержание V₂-изоформы в желудочковом миокарде составляет более 25% от всех тяжелых миозиновых цепей; б) в миокарде предсердий V₂-фракция на электрофореграммах не выявляется ни на одной из исследуемых стадий кардиогенеза.

Рис. 41. Соотношение значений плотности упаковки миофибрилл (Vv), степени ориентации миофибрилл (Vo) и абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл (Sv) в саркоплазме сократительных кардиомиоцитов различных зон сердечной стенки и отделов сердца человека на этапах онтогенеза. СЭП - субэпикардиальная зона; ИМЗ - интрамуральная зона; СЭН - субэндокардиальная зона; ЛЖ и ПЖ - левый и правый желудочки; ЛП и ПП - левое и правое предсердия; МЖП и МПП - межжелудочковая и межпредсердная перегородки.

После 28-й недели внутриутробного периода в миокарде человека, а также в раннем перинатальном периоде в сердце крыс стабильно определяется отчетливая гетерогенность кардиомиоцитов по АТФазной активности миофибрилл. Тем не менее, распределение гистохимической метки имеет ряд отличительных особенностей от картины, наблюдаемой в зрелом миокарде.

Во-первых, в миокарде желудочков продолжают встречаться единичные клетки, содержащие V₂-изомолекулярную форму тяжелых цепей миозина, которые обладают минимальной АТФазной активностью" (Рис.37).

Во-вторых, некоторые сократительные клетки по-прежнему содержат признаки неравномерного распределения АТФазной активности в составе миофибрилл (Рис.38), причем иногда мозаичность внутриклеточного распределения метки наблюдается даже в тех случаях, когда соседние тканевые участки в целом не отличаются друг от друга (Рис.39).

В-третьих, предсердные кардиомиоциты с высокой АТФазной активностью (содержаще V3-тяжелые цепи миозина) иногда проявляют признаки релаксации в отличие от соседних V1-содержащих сократительных клеток с умеренной активностью АТФ-азы (Рис.40), причем такие миоциты обнаруживаются лишь в предсердие миокарде человека (но не крысы). Возможно, что эта видаспецифическая особенность отражает относительно высокий уровень протекания анаэробных реакций в предсердном миокарде человека, обусловливая поддержание физиологического ацидоза за счет активного образования молочной кислоты и ряда соответствующих метаболитов (более подробно вопросы энергетического метаболизма миокарда будут рассмотрены в 4-й главе).

Изложенные результаты показывают, что развитие сократительного аппарата кардиомиоцитов сопровождается весьма сложными и неоднонаправленными перестройками белкового спектра миофибрилл и их АТФазной активности, приводящими к выраженной функциональной гетерогенности кардиомиоцитов. При этом характер осуществления указанных перестроек неодинаков в желудочках и предсердиях как в сердце человека, так и у крыс. На этом этапе становится актуальным вопрос о количественной оценке степени гетерогенности различных участков миокарда с учетом ультраструктурных и функциональных параметров сократительных кардиомиоцитов.

Рис. 42. Соотношение значений плотности упаковки миофибрилл (Vv), степени ориентации миофибрилл (Vo) и абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл (Sv) в саркоплазме сократительных кардиомиоцитов различных зон сердечной стенки и отделов сердца человека на этапах онтогенеза. СЭП - субэликардиальная зона; ММЗ - интрамуральная зона: СЭН - субэндокардиальная зона; ЛЖ и ПЖ - левый и правый желудочки; ЛП и ПП - левое и правое предсердия; МЖП и МПП - межжелудочковая и межпредсердная перегородки.

Результаты ультраструктурнаго стереологического исследования показывают, что на начальных этапах кардиогенеза человека (на 5-6й неделе эмбрионального развития) плотность упаковки миофибрилл в составе сократительных кардиомиоцитов желудочков и предсердий не имеет существенных различий. Статистически значимые различия параметров не установлены также между субэпикардиальной, интрамуральной и субэндокардиальной зонами миокарда обоих желудочков, а также в межжелудочковой и межпредсердной перегородках (Рис.41).

 Начиная с 7-й недели плодного периода наблюдается чрезвычайно активное накопление миофибриллярной массы в желудочковых кардиомиоцитах, причем темпы накопления сократительных структур наиболее выражены в субэндокардиальной зоне желудочковой стенки. Вполне возможно, что это является отражением более "выигрышной" локализации субэндокардиальных клеток в отношении доступа к кислороду и энергетическим метаболитам непосредственно из полостей и синусоидов в тот период, когда развитие вторичного гемомикроциркуляторного русла в компактном миокарде интрамуральной и субэпикардиальной зон находится в зачаточном состоянии. В пользу данного предположения свидетельствуют также более высокие значения степени ориентации миофибрилл в субэндокардиальной зоне (Рис.41), которые являются косвенным отражением более высокой функциональной активности сократительных структур указанных кардиомиоцитов.

На протяжении эмбрионального периода кардиогенеза человека (7-8-я неделя внутриутробного развития) показатели плотности упаковки, абсолютной удельной площади поверхности и степени ориентации миофибрилл не отличаются в статистически значимой мере от значений, установленных в предшествующей хронологической группе (6-я неделя эмбриогенеза). Ультраструктурометрические данные в миокарде межпредсердной перегородки приближаются по своим величинам к параметрам в предсердиях, тогда как в межжелудочковой перегородке наблюдаются существенно сниженные (по сравнению с желудочками) значения изученных показателей (Рис.41).

В раннем постэмбриональном периоде развития человека (10-14-я неделя внутриутробного развития) насыщенность субэндокардиальных сократительных клеток миофибриллами продолжает заметно превышать значения в субэпикардиальной и интрамуральной зонах миокарда левого желудочка, тогда как в правом желудочке плотность упаковки миофибрилл уже не различается в статистически значимой степени в различных зонах сердечной стенки (Рис.42). Указанные сдвиги происходят на фоне активного нарастания абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл, что указывает на активное их новообразование без заметного утолщения предсуществующих саркомеров.

Рис.43. Соотношение значений плотности упаковки миофибрилл (Vv), степени ориентации миофибрилл (Vo) и абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл (Sv) в саркоплазме сократительных кардиомиоцитов различных зон сердечной стенки и отделов сердца человека на этапах онтогенеза. СЭП - субэликардиальная зона; ИМЗ - инграмуральная зона; СЭН - субэндокардиальная зона; ЛЖ и ГГЖ - левый и правый желудочки; ЛП и ПП - левое и правое предсердия; МЖП и МПГГ - межжелудочковая и межпредсердная перегородки.

В миокарде предсердий, а также межпредсердной перегородки происходит активизация процессов миофибриллогенеза, что приводит к выраженному накоплению миофибриллярной массы в саркоплазме предсердных сократительных кардиомиоцитов. При этом абсолютная удельная площадь поверхности миофибрилл заметно уступает по своим значениям тем величинам, которые характерны для желудочковых клеток (Рис.42). На электроннограммах сократительный аппарат предсердных миоцитов был представлен относительно тонкими миофибриллами, не имеющими определенной степени ориентации.

В миокарде межжелудочковой перегородки накопление сократительных структур сопоставимо по темпам с показателями желудочков, однако значения степени ориентации миофибрилл и абсолютной удельной площади поверхности миофибриллярного аппарата значительно меньше по сравнению с соответствующими показателями клеток в составе левого и правого желудочков (Рис.42).

Активные объемные преобразования сократительного аппарата кардиомиоцитов в составе желудочков приводят к тому, что начиная с 16й недели плодного развития плотность упаковки миофибрилл в субэпикардиальной и интрамуральной зонах сердечной стенки преобладает над величинами, установленными в субэндокардиальной зоне. Такое соотношение характерно для обоих желудочков, однако в дальнейшем (24-28-я неделя внутриутробного развития) между левым и правым желудочками также устанавливается гетерогенитет по значениям плотности упаковки миофибрилл. Напротив, значения степени ориентации и абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл не имеют статистически значимых различий в изученных зонах обоих желудочков. После 32й недели кардиргенеза отсутствуют выраженные сдвиги изучаемых параметров миофибрилл (Рис.43).

Дефинитивная структура миофибриллярного аппарата в желудочковом миокарде имеет следующие характерные черты: 1) величины плотности упаковки миофибрилл распределяются в последовательности: субэпикардиальная зона правого желудочка - субэпикардиальная и интрамуральная зоны левого желудочка - интрамуральная зона правого желудочка - субэндокардиальная зона правого и левого желудочков; 2) абсолютная удельная площадь поверхности миофибрилл не имеет существенных различий во всех зонах желудочков; 3) наивысшие значения степени ориентации миофибрилл определяются в интрамуральной зоне правого желудочка, наименьшие - в субэндокардиальной зоне правого желудочка.

Рис. 44. Соотношение значений плотности упаковки миофибрилл (Vv), степени ориентации миофибрилл (Vo) и абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл (Sv) в саркоплазме сократительных кардиомиоцитов различных зон сердечной стенки и отделов сердца крысы на этапах онтогенеза. СЭП - субэпикардиальная зона; ИМЗ - интрамуральная зона; СЭН - субэндокардиальная зона; ЛЖ и ПЖ - левый и правый желудочки; ЛП и ПП - левое и правое предсердия; МЖП и МПП - межжелудочковая и межпредсердная перегородки.

Сдвиги ультраструктурных характеристик в миокарде предсердий на протяжении последнего триместра беременности заключаются в умеренном нарастании плотности упаковки миофибрилл и выраженном увеличении степени ориентации (Рис.43); тем не менее, дефинитивные значения показателей (устанавливающиеся с 32-й по 40-ю неделю внутриутробного развития) все же не достигают уровня, характерного для желудочковых кардиомиоцитов. В миокарде правого предсердия насыщенность саркоплазмы сократительных клеток ииофибриллами более чем в 2 раза уступает желудочковым клеткам и в 1,3 раза - клеткам левого предсердия. Сходные сдвиги характерны также для показателей степени ориентации и абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл (Рис.43).

Наряду с описанными изменениями, дефинитивная структура сократительного миокарда человека предусматривает выраженные отличия кардиомиоцитов межпредсердной и межжелудочковой перегородок от значений, установленных в миокарде предсердий и желудочков. Так, изученные стереологические показатели сократительных клеток межжелудочковой перегородки на этапах позднего плодного развития, а также в сердце 40-недельных плодов человека занимают промежуточное положение между желудочковыми и предсердными кардиомиоцитами (Рис.43). В межпредсердной перегородке в указанный период уровень развития миофибрилл является наименьшим по сравнению со всеми другими исследованными участками миокарда.

При ультраструктурометрии развивающегося миокарда крыс в динамике параметров обнаруживаются общие тенденции, установленные в миокарде эмбрионов и плодов человека (Рис.44). Обращают на себя внимание две характерные особенности, наблюдаемые в развитии миофибрилл в сердце крыс после рождения животных.

Первой из них является значительное нарастание абсолютной удельной площади поверхности сократительных структур, превышающей значения в миокарде человека, однако при этом соотношения величин в различных зонах сердечной стенки и отделах сердца не имеют видовой специфичности (Рис.45). Мы полагаем, что это обусловливается характерным свойством миокарда человека формировать так называемую Felderstruktur миофибрилл, приводящую к накоплению сплошной миофибриллярной массы в саркоплазме сократительных клеток и, следовательно, к некоторому снижению площади поверхности миофибрилл. В миокарде мелких животных, в том числе у грызунов, миофибриллярный аппарат организован по типу Fibrillenstruktur; дифференцировка кардиомиоцитов способствует значительному уплотнению миофибрилл в саркоплазме, но не их слиянию в сплошные массы.

Рис. 45. Соотношение значений плотности упаковки миофибрилл (Vv), степени ориентации миофибрилл (Vo) и абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл (Sv) в саркоплазме сократительных кардиомиоцитов различных зон сердечной стенки и отделов сердца крысы на этапах онтогенеза. СЭП - субэпикардиальная зона; ИМЗ - интрамуральная зона; СЭН - субэндокардиальная зона; ЛЖ и ПЖ - левый и правый желудочки; ЛП и ПП - левое и правое предсердия; МЖП и МПП - межжелудочковая и межпредсердная перегородки.

Вторая особенность, наблюдаемая в постнатальном миокарде крыс; заключается в существенном опережающем развитии сократительного аппарата кардиомиоцитов в правом желудочке по сравнению с левым, что особенно отчетливо заметно в субэндокардиальной зоне в первые дни жизни животных (Рис.45; 48). Возможно, что это обусловливается коренными преобразованиями центральной гемодинамики у новорожденных крыс и отражает процессы активного включения миокарда правого желудочка в легочный круг кровообращения.

Таким образом, на этапах кардиального гистогенеза, а также в дефинитивном миокарде человека и крыс существует выраженный гетерогенитет между различными отделами сердца и зонами сердечной стенки по характеру развития миофибрилл, однако в составе каждой из указанных зон сократительный миокард прэдставляет собой также далеко не однородную клеточную популяцию кардиомиоцитов. Одним из наиболее отчетливых количественных критериев, отражающих клеточную неоднородность миокарда в различных зонах и отделах сердца, является соотношение между отдельными клеточными типами (по характеру функциональной активности миофибрилл).

Решение этого вопроса в миокарде поздних плодов человека и у крыс после 30х суток постнатального онтогенеза не представляет трудности, так как в этот период кардиомиоциты содержат в своем составе дефинитивно сформированные миофибриллы, которые альтернативно содержат либо "зрелые", либо "эмбриональные" изомолекулярные формы саркомерных белков. В этом случае решение вопроса можно было бы свести к подсчету численности каждого из типов клеток.

Гораздо более сложной является характеристика гетерогенности миокарда на предшествующих этапах кардиогенеза, когда определенное количество сократительных клеток содержит смешанные миофибриллярные комплексы и представляет собой широкий спектр "переходных" кардиомиоцитов. Исходя из приведенных предпосылок, нами рассчитан параметр "функциональной" гетерогенности кардиомиоцитов на основании градиента цитоспектрофотометрических значений АТФазной активности сократительных клеток, установленных в саркоплазме индивидуальных кардиомиоцитов в изучаемых отделах сердца и зонах сердечной стенки.

Рис. 46. Соотношение значений плотности упаковки миофибрилл (Vv), степени ориентации миофибрилл (Vo) и абсолютной удельной площади поверхности миофибрилл (Sv) в саркоплазме сократительных кардиомиоцитов различных зон сердечной стенки и отделов сердца крысы на этапах онтогенеза. СЭП - субэпикардиальная зона; ИМЗ - интрамуральная зона; СЭН - субэндокардиальная зона; ЛЖ и ПЖ - левый и правый желудочки; ЛП и ПП - левое и правое предсердия; МЖП и МПП - межжелудочковая и межпредсердная перегородки.

Результаты измерений и соответствующих расчетов показывают, что в раннем эмбриональном миокарде крыс и в развивающемся сердце человека до 7-й недели эмбрионального периода миокард представлен однородными в функциональном отношении тканевыми комплексами - показатели гетерогенности как в предсердиях, так и в различных зонах стенки желудочков имеют значения, близкие к нулевым.

В последующем наблюдается резкое нарастание параметров "функциональной" гетерогенности в желудочковом миокарде человека и крыс, особенно отчетливо выраженное в субэндокардиальной зоне сердечной стенки обоих желудочков (Рис.47; 48). К концу 12-й недели плодного периода у человека и у 20-суточных эмбрионов крыс степень гетерогенности кардиомиоцитов в субэндокардиальных комплексах миокарда на 31-36% превышает значения в других участках стенки левого желудочка.

В интрамуральной. субэпикардиальной и субэндокардиальной зонах стенки правого желудочка наблюдаются те же соотношения, что и в левом, однако различия между зонами выражены в меньшей степени.

Необходимо отметить, что в изучаемый период электорофаретическое разделение изомолекулярных форм сократительных белков не выявило сколько-нибудь выраженного гетерогенитета миофибрилл по включению V₁, V₂ и V₃-изоформ тяжелых цепей миозина, обладающих АТФазной активностью. Очевидно, что наблюдаемые сдвиги в показателях "функциональной" гетерогенности желудочковых кардиомиоцитов обусловливаются не различиями в белковом спектре сократительных структур отдельных клеток, а различной степенью насыщенности этих клеток миофибриллами.

В миокарде желудочков сердца человека с 12-й по 16-ю неделю плодного развития происходит стабилизация значений показателя "функциональной" гетерогенности кардиомиоцитов, однако в дальнейшем наблюдается новый период активного нарастания гетерогенитета сократительных клеток. В этот период, хронологически соответствующий активным перестройкам белкового спектра контрактильных белков миофибрилл, кардиомиоциты интрамуральной и субэпикардиальной зон стенки левого и правого желудочков резко увеличивают свою неоднородность по гистохимически выявляемой АТФазной активности миофибрилл; в субэндокардиальной зоне подобные сдвиги выражены гораздо в меньшей степени (Рис.47; 48). В результате этого величина показателя "функциональной" гетерогенности сократительных клеток в составе интрамуральной и субэпикардиальной зон начинает превышать соответствующее значение в субэндокардиальной зоне. К 32-й неделе внутриутробного развития человека во всех зонах стенки левого и правого желудочков достигаются дефинитивные значения параметров гетерогенности кардиомиоцитов, причем уровень разнообразия субэндокардиально расположенных клеток составляет 74-77% от показателей, установленных в интрамуральной и субэпикардиальной зонах. Достижение дефинитивного уровня "функциональной" гетерогенности сократительных клеток хронологически соответствует стабилизации данных электрофоретического разделения белкового спектра миофибрилл.

Рис. 47. Динамика нарастания параметра «функциональной» гетерогенности кардиомиоцитов левого желудочка в развивающемся сердце человека и крысы. СЭнЗ - субэндокардиальная зона; ИМЗ интрамуральная зона; СЭпЗ - субэпикардиальная зона.

В желудочковом миокарде крыс обнаруживаются принципиально сходные по своему характеру сдвиги показателей гетерогенности сократительных кардиомиоцитов: второй период активного нарастания неоднородности миоцитов наблюдается на фоне активных изоформных преобразований в белковом спектре миофибрилл. Дефинитивный уровень развития "функциональной" гетерогенности кардиомиоцитов в различных зонах левого и   правого желудочков устанавливается к концу 1-го месяца жизни животных (Рис.47; 48).

При изучении миокарда предсердий в сердце плодов человека и раннем перинатальном сердце крыс обнаруживаются выраженные отличия от тех сдвигов, которые характеризуют желудочковые кардиомиациты. Так, степень "функциональной" гетерогенности предсердных кардиомиоцитов длительное время остается на фоновом уровне; лишь после 14-й недели внутриутробного развития человека и у новорожденных крыс гистохимические различия между сократительными клетками начинают существенно возрастать, причем в левом предсердии темпы увеличения показателей гетерогенности миокарда заметно опережают таковые в правом предсердии (Рис.49).

Рис. 48. Динамика нарастания параметра «функциональной» гетерогенности кардиомиоцитов правого желудочка в развивающемся сердце человека и крысы. СЭнЗ - субэндокардиальная зона; ИМЗ интрамуральная зона; СЭпЗ - субэпикардиальная зона.

Характерно, что в раннем плодном периоде кардиогенеза человека и в позднем пренатальном кардиальном миогенезе крыс ультраструктурометрические показатели развития сократительного аппарата заметно различаются в правой и левом предсердиях, однако это не послужило причиной для формирования выраженного гетерогенитета сократительных клеток внутри определенных клеточных комплексов. По всей видимости, определяющим фактором для проявления данного феномена служит однородность миофибрилл по включению V₁-изомолекулярной формы тяжелых цепей миозина, которая в изучаемый период является единственной на электрофореграммах предсердного миокарда; при этом различия между миоцитами по уровню плотности упаковки миофибрилл не имеют статистической значимости.

Рис. 49. Динамика нарастания параметра "функциональной" гетерогенности предсердных кардиомиоцитов в развивающемся сердце человека и крысы. ПП - правое предсердие; ЛП - левое предсердие.

Динамика показателей "функциональной" гетерогенности сократительных клеток в позднем плодном развитии человека и в перинатальном онтогенезе крыс имеет три характерные особенности: 1) в правом предсердии наблюдается первоначальное повышение величин параметра неоднородности с последующим снижением до уровня 24-26%; 2) дефинитивный уровень гетерогенности достигается на 32й неделе внутриутробного развития человека и на 30-е сутки постнатального онтогенеза крыс; 3) в дефинитивном миокарде человека и крысы степень "функциональной" неоднородности кардиомиоцитов в правом предсердии заметно уступает уровню левого предсердия (Рис.49).

Количественный гистохимический анализ АТФазной активности кардиомиоцитов в составе межжелудочковой и межпредсердной перегородок показывает, что дефинитивный уровень их "функциональной" гетерогенности достигается в тот же период, что и в других участках сократительного миокарда (в предсердиях и различных зонах стенки желудочков), однако степень неоднородности клеток по активности миофибрилл в составе межжелудочковой перегородки занимает промежуточное положение между значениями предсердий и желудочков, а в межпредсердной перегородке обнаруживают минимальные значения показателя "функциональной" гетерогенности среди всех изученных участков мышцы сердца (Рис.50).

Рис. 50. Динамика нарастания параметра "функциональной" гетерогенности кардиомиоцитов в межпредсердной (МПП) и межжелудочковой (МЖП) перегородках развивающегося сердца человека и крысы.

Приведенные данные в существенной мере коррелируют с результатами ультраструктурного анализа, однако отражают не суммарную характеристику развития миофибрилл в той или иной зоне желудочкового или предсердного миокарда, а выражают степень гетерогенности отдельных миокардиальных клеток по функциональной активности сократительных структур, которая основана на различиях в изомолекулярном спектре контрактильных белков.

Таким образом, представленные в настоящей главе данные электронной микроскопии, количественной гистохимии и биохимии позволяют заключить, что сократительный аппарат кардиомиоцитов на ранних этапах эмбриогенеза человека и крыс представлен двумя классами структур - незрелыми миофибриллами и актиновыми полигонами, которые играют важную координирующую роль в процессах миофибриллогенеза и обладают самостоятельной сократительной активностью. Развитие миофибрилл сопровождается преобразованиями белкового состава актомиозиновых комплексов, направленными на замещение "эмбриональных" изомолекулярных форм "зрелыми". Указанное замещение осуществляется по-разному в различных участках миокарда и обусловливает формирование гетерогенности отделов сердца и зон сердечной стенки по структурным и функциональным характеристикам сократительного аппарата кардиомиоцитов. Наиболее активно перестройки белкового состава миофибрилл в миокарде человека происходят с 16й по 28-ю неделю плодного периода, в миокарде крыс - с 1-х по 20-е сутки постнатального онтогенеза.

Дефинитивный уровень развития сократительного аппарата кардиомиоцитов в сердце человека достигается на 32-й неделе плодного периода, в миокарде крыс - на 30-е сутки постнатального онтогенеза. В этот период миокард содержит два типа сократительных кардиомиоцитов. Миофибриллы в клетках I типа ("активных") состоят из "зрелых" изомолекулярных форм сократительных белков и обладают высокой АТФазной активностью, низкой чувствительностью к внутриклеточной концентрации Са²⁺ и низкой устойчивостью к ацидозу. Актомиозиновые комплексы в составе кардиомиоцитов II типа ("резервных") содержат "эмбриональные" бежовые изоформы и проявляют умеренную АТФазную активность, высокую чувствительность к уровню Са²⁺ и повышенную устойчивость к ацидозу. Сосуществование "эмбриональных" и "зрелых" изомолекулярных форм саркомерных белков в пределах одной клетки наблюдается в период активных изоформных преобразований миофибрилл и становится невозможным после их завершения: смешанные (переходные) типы сократительных кардиомиоцитов по характеру сократительного аппарата в зрелом миокарде человека и крыс отсутствуют.

В интрамуральной и субэпикардиальной зонах миокарда желудочков выраженно преобладают "активные" кардиомиоциты I типа. "Резервные" миоциты II типа объединяются в варьирующие по численности клеточные группы либо располагаются одиночно; в систолической фазе они находятся в релаксированном состоянии, но их мембраны обладают способностью к проведению электрофизиологического импульса. Степень "функциональной" гетерогенности клеток в указанных зонах является наивысшей.

В миокарде левого и, в большей степени, правого предсердий преобладают клетки II типа. Степень развития сократительного аппарата и степень "функциональной" гетерогенности кардиомиоцитов в предсердном миокарде существенно уступает показателям желудочков. Минимальный уровень неоднородности сократительных клеток установлен в миокарде межпредсердной перегородки; миоциты межжелудочковой перегородки по показателям развития миофибрилл и степени своей "функциональной" гетерогенности занимают промежуточное положение между параметрами желудочков и предсердий.

Твердохлеб И.В. Гетерогенность миокарда и ее развитие в нормальном кардиомиогенезе: Монография. - Днепропетровск: «Пороги», 1996. - 224с.   Глава 1. Развитие структурных и функциональных факторов гетерогенности сократительного аппарата;   Глава 2. Формирование гетерогенности митохондриального аппарата кардномиоцитов;   Глава 3. Формирование гетерогенности секреторного аппарата;   Глава 4. Формирование метаболической гетерогенности миокарда;   Глава 5. Структурно-метаболическая гетерогенность миокарда в топологическом и хронологическом аспектах.