Сердце, логотип
www.CARDIOGENES.dp.ua
строение и развитие сердечно-сосудистой системы
Кардиогенез :: Механизмы пролиферации кардиомиоцитов…
 
Гистогенетические процессы в развивающемся миокарде (Шпонька И.С., монография), 1996
(Шпонька И.С. Гистогенетические процессы в развивающемся миокарде млекопитающих: монография.- Дн-вск, 1996)
с.5-39
[ ⇐ назад | вперед ⇒ ]

Глава 1 Пролиферация

Количественная оценка механизмов пролиферации кардиомиоцитов млекопитающих

Клеточное размножение, или пролиферация, является одним из существенных компонентов гистогенеза, определяющим рост ткани и органа, изменяющим соотношение между клеточными популяциями (А.А.Клишов, 1984).

Изучение пролиферации клеток тканей и, в частности, миокарда традиционно связывают с исследованием клеточного цикла и, чаще всего, с кинетикой размножения ядер. Использование меченых радиоактивными изотопами предшественников синтеза ДНК при изучении развития миокарда позволило выявить общую закономерность для всех экспериментальных животных, заключающуюся в угасании синтеза дезоксирибонуклеиновых кислот в кардиомиоцитах на протяжении пре- и постнатального онтогенеза. Темпы снижения редупликационной способности ядер, а также период полного исчезновения этой способности имеют яркие видовые различия (П.П.Румянцев, 1982).

Установлено, что количество кардиомиоцитов сохраняющих пролиферативную активность, контролируемую по индексу S-фазы, к моменту рождения коррелирует с биологическим возрастом, достигаемым видом к этому сроку. Так, ядра кардиомиоцитов относительно незрелых новорожденных крыс и мышей еще способны к синтезу ДНК (И.Л.Ерохина, 1968; П.П.Румянцев, 1978), а пролиферативный потенциал мышечных клеток сердца морских свинок, появляющихся на свет зрячими и активными, полностью исчерпывается к периоду внеутробной жизни (Л.И.Ерохина, П.П.Румянцев, 1970).

На динамике индекса меченых ядер (ИМЯ) существенным образом сказывается не только видовая, но и индивидуальная скорость созревания, благодаря чему в любом возрастном периоде очень высока индивидуальная вариабельность этого показателя (П.П.Румянцев. 1978); это однако, не определяет различные сроки исчезновения способности мышечных ядер миокарда включать 3H-тимидин, приводимые разными авторами - конец 3-й недели жизни крыс (А.Г.Жамгарян. В.О.Миракян, 1977; П.П.Румянцев, 1978; Sasaki et al., 1970; Rumyantsev., 1977), конец 2-го месяца жизни крыс (Klinge. 1970; Kunz et al., 1972; Кгаnz et al., 1975). Указанное несоответствие обусловлено, по-видимому, применением не исключающей ошибок в идентификации клеток световой микроскопии при изучении радиоавтографов.

Другим показателем, позволяющим оценить кинетику ядер и клеток развивающегося миокарда, является митотический индекс. Динамика его в ходе кардиогенеза во многом сходна с изменениями, испытываемыми ИМЯ, причем снижение митотического индекса до нулевых значений практически совпадает по времени с прекращением включения 3Н-тимидина в ядра кардиомиоцитов (Л.И.Ерохина. 1968; П.П.Румянцев, 1978). В пренатальном онтогенезе у крыс и мышей динамики митотического индекса и индекса S-фазы кардиомиоцитов не всегда характеризовались однонаправленными сдвигами (Л.И.Ерохина, 1968; П.П.Румянцев. 1978), что возможно, связано с периодичностью вступления большого количества клеток в S или M фазы клеточного цикла.

Отчетливо демонстрируя кинетику размножения ядер миокарда, указанные показатели не всегда точно отражают кинетику собственно клеточного деления. Это становится очевидным, в период образования двуядерных кардиомиоцитов. У крыс и мышей полиплоидизация мышечных клеток миокарда (т.е. образование двух- и многоядерных клеток или клеток с полиплоидным геномом) отчетливо выражена в первые недели жизни (В.Я.Бродский и др.. 1980; Каtzberg et al., 1977; Kоrеcky et al., 1979; Аnversa et al., 1980), когда значения митотического индекса и индекса меченых ядер еще достаточно высоки, а нарастания количества кардиомиоцитов практически не происходит (David et al., 1981; Brodsky et аl.,  1983).

Таким образом, индекс меченых ядер отражает в постнатальном онтогенезе крыс и мышей, скорее процесс полиплоидизации на чем внимание исследователей не акцентировалось. Что касается митотического индекса, то несмотря на наличие работ, в которых пролиферативная активность кардиомиоцитов в постнатальном онтогенезе оценивалась именно по этому показателю (Г.Б.Большакова. 1980; В.Ф.Сидорова. Г.Б.Большакова. 1980), корректными представляются лишь исследования митотического индекса мышечных клеток сердца с учетом всех фаз митоза (Г.Б.Большакова. 1981), что дало возможность установить отсутствие последних стадий митоза - ана- и телофазы - в кардиомиоцитах левого желудочка сердца крыс после 9-х суток жизни.

Оценка тотального количества клеток на различных стадиях онтогенеза является одним из методов, позволяющих непосредственно изучить пролиферацию клеточных элементов миокарда; однако, как правило, при этом производится подсчет абсолютного количества ядер, что требует дальнейшего пересчета в соответствии в числом одно- и многоядерных кардиомиоцитов и стромальных клеток (Л.И.Ерохина, 1968; Sasaki et al., 1968; Anversa et al., 1980).

Раздельное определение количества мышечных ядер и ядер стромальных клеток у мышей подтверждает окончание пролиферации ядер кардиомиоцитов к срокам, определенным по индексу меченых ядер и митотическому индексу; оценка же абсолютного числа ядер дает огромный разброс при использовании различных методов (Л.И.Ерохина. 1968; Л.Н.Белов и др.. 1977). У человека пролиферация кардиомиоцитов изучалась по динамике количества мышечных ядер, число которых стабилизируется ко 2-му месяцу жизни (Ноrt, 1953). Биохимическое определение концентрации ДНК в гомогенате миокарда свидетельствует о прекращении митотического размножения кардиомиоциов человека сразу после рождения; напротив, количество немышечных ядер возрастает в постнатальном развитии в 5 раз (Adler, Sandritter, 1971; Adler., 1972; 1976; Cluzeaut. 1986). Увеличение численности стромальных клеток в течение жизни и количественное преобладание их в миокарде взрослых особей установлено для крыс и мышей (Л.И.Ерохина, 1968; Sasaki et al., 1968).

Редубликация генома кардиомиоцитов человека и обезьян возможна и в постнатальном онтогенезе, подтверждением чему является феномен выраженной полиплоидизации ядер мышечных клеток сердца, явные признаки которой наблюдаются, начиная с 1-го месяца жизни человека по данным В.О.Миракяна. Д.Г.Петросяна (1976), Adler. Hueck (1971), Adler (1976), или после 1-го года жизни (Takamatsu et al., 1983). Природа полиплоидизации мышечных ядер и клеток сердца человека и обезьян полностью не выяснена, в отличие от установленного механизма полишюидизации кардиомиоцитов мышей, заключающегося в прохождении клетками ацитокинетического, полиплоидизирующего митоза (И.В.Урываева и др., 1980). Образование полиплоидных кардиомиоцитов у мышей существенно отличается по биологическим признакам от полиплоидизации, наблюдаемой в клетках других органов (В.Ф.Иванов, 1984).

Не вполне объяснен механизм увеличения, а затем снижения числа двуядерных кардиомиоцитов в постнатальном развитии человека; количественные данные, характеризующие эти процессы несколько разноречивы (И.Д.Шперлинг. Л.А.Аракелян, 1989; Scneider, Pfitzer., 1973). По мнения Pfitzer (1972; 1980). Grabner. Pfitzer (1974), полиплоидизация кардиомиоцитов человека - следствие аномально протекающего митоза, а у свиней и приматов незавершенность клеточного цикла является основным законом возникновения полиплоидных мышечных клеток (Pfitzer et al., 1977).

Регуляция пролиферации клеток миокарда со стороны организма, как мы уже указывали, происходит в соответствии со скоростью биологического созревания вида и особи. В.Я.Бродский с соавт. (1986; 1991), И.Д. Шперлинг, Л.А.Аракелян (1989) и Adler, Schoff (1983) подтвердили наличие временного контроля в процессе роста сердца, зависимость количества ДНК в дефинитивном сердце и количества клеточных генераций от темпов развития вида и особи. Это иллюстрируется индивидуальными вариациями не только в индексе меченых ядер и митотическом индексе на стадиях онтогенеза, но и различиями в количестве кардиомиоцитов у особей одного возраста и с близкой массой сердца (В.Я.Бродский и др., 1983; Й.Д.Шперлинг, Л.А.Аракелян, 1989; Brodsky et al., 1985).

Очевидно, что огромную роль в регуляции пролиферации кардиомиоцитов играет их нарастающая дифференцировка. Выход миоцитов сердца крыс из митотического цикла совпадает как с накоплением "критической" массы миофибрилл (П.П.Румянцев, 1972; 1973; Rumyantsev 1963; 1976), так и с дифференцировкой структур, появление которых совпадает с прекращением размножения кардиомиоцитов,- нексусов (Bugaisky. Zak. 1979), Т-системы; причем стадии развития сердца, когда начинает формироваться Т-система, идентичны у различных животных (Forbes. Sperelakis, 1984).

Конкретные механизмы контроля пролиферации кардиомиоцитов связывают с молекулами самых разных классов. По мнению П.П.Румянцева (1982), наиболее обоснована концепция контроля митотической активности кардиомиоцитов ферментами репликации - а-ДНК-полимеразой и тимидинкиназой, активность которых снижается в раннем постнатальном развитии крыс до минимума (С1аусоmb. 1973; 1975; Doyle et al., 1974; Fischman et al., 1975; Hubscher et а1., 1977; Limas et al., 1978).

Сдвиги в митотической активности кардиомиоцитов также связаны с изменениями свойств хроматина, обусловливающими ограничение его способности к репликации, - с усилением связи ДНК с гистонами, возрастанием количества гистона Н1 (Limas. Chan-Stier 1978). усилением поли-(АДФ)-рибозилирования хромосомных белков (Claycomb. 1976а. 1976с; Ghani-Hollenberg. 1978).

Рис.1. Митотические фигуры сократительных КМЦ кролика на 10-е сут.

Возрастающая дифференцировка кардиомиоцитов сопровождается накоплением внутриклеточных катехоламинов и цАМФ (Claycomb, 1976), свидетельством участия которых в регуляции пролиферации является повышение синтетический способности ядер кардиомиоцитов после десимпатизации (Kugler et al., 1980). Позитивный контроль размножения культивируемых мышечных клеток сердца осуществляют ионы Са2+, экстракты из миокарда молодых животных (Limas. 1979); тогда как вытяжка из гомогената зрелых особей, напротив, подавляет синтетическую способность кардиомиоцитов (Hurrelbrink, С1аусоmb, 1978).

Необходимо отметить, что пролиферативный процесс в гистогенезе миокарда имеет ряд органотипических особенностей, связанных с тем, что после эффективной редукции митотической активности кардиомиоцитов в эмбриональном периоде продолжаются достаточно сложные перестройки генетического материала ткани, которые вызывают к необходимости формирование двуядерных и многоядерных сократительных клеток, а в последующем - также образование полиплоидных ядер.

В наших исследованиях в миокарде трубчатого сердца изученных млекопитающих (4-я неделя эмбриогенеза у человека; 10-е сутки - у крыс; 9-е сутки - у мышей; 10-е сутки - у кролика) обнаружены многочисленные митотические фигуры кардиомиоцитов (Рис.1), содержащих признаки слабой цитодифференцировки (Рис.2). Морфология митотически делящихся клеток имеет сходные ультраструктурные характеристики. В ранней профазе отмечаются многочисленные участки конденсации хромосомного материала. По сравнению с соседними интерфазными кардиониоцитани содержание организованных миофибрилл резко снижается. При этом связь митотических клеток с окружающими миоцитами не утрачивается (Рис.3).

Рис.2. Разнонаправленная ориентация митотически делящихся КМЦ.

В поздней профазе поверхность хромосом неровная, с многочисленными выпячиваниями. Ядерная мембрана расчленена на множество фрагментов, часть которых приобретает форму тонких цистерн.

Метафазные кардиомиоциты содержат хромосомы, полностью высвобожденные из ядерной мембраны. В саркоплазме отсутствуют организованные миофибриллы. Ни одна из изученных митотических клеток на стадии метафазы не содержит саркомеров с зачатками 2-дисков; свободные миофиламенты в ограниченном количестве обнаруживаются группами в дистальных полюсах несколько удлиненных кардиомиоцитов. Центральная часть метафазных клеток в этот период накапливает значительное число микротрубочек. Характерно, что митохондрии в этом месте имеют очень небольшие размеры и умеренно плотный матрикс, тогда как на периферии миоцитов обнаруживаются полиморфные органеллы с просветленным матриксом.

Рис.3. Ранняя профаза сократительного КМЦ.

При переходе в анафазу значительное число гранул гликогена располагается в непосредственной близости к хромосомам; вероятно, на ранних стадиях кардиомиогенеза при слабом развитии митохондриального аппарата гликоген выполняет роль основного энергетического источника для обеспечения митотического деления кардиомиоцитов.

На протяжении телофазы отмечается восстановление ядерной мембраны; митохондрии и элементарные нити смещаются в интерзону (Рис.4). Важно отметить, что, в отличие от митозов эндотелиальных клеток (Рис.5), мы не наблюдали случаев начала цитокинеза до полного восстановления целостности ядерной мембраны.

Анализ серийных полутонких срезов в зоне цитокинеза позволил обнаружить в составе межклеточного мостика варьирующие по численности плотные гранулы диаметром до 0.2 мкм (Рис.6). Морфологически эти гранулы соответствуют секреторным гранулам малодифференцированных кардиомиоцитов, описанных Manasek (1969). На полутонких срезах миокарда, окрашенных по Kurotaki, обнаруживаются длинные миофибриллярные пучки, проходящие через ряд сократительных клеток, а также - транзитом - через саркоплазму митотически делящегося кардиомиоцита. На рисунке 7 отчетливо заметно, что поперечная исчерченность такого миофибриллярного пучка в пределах митотической клетки нарушена; соответственно наблюдаются признаки диссоциации миофибрилл.

 

Рис.4. Поздняя телофаза сократительной клетки в миокарде Рис.5. Митоз эндотелиальной клетки в миокарде человека Рис.6. Цитокинез сократительного КМЦ

На этапе трубчатого сердца обнаруживаются высокие значения митотического индекса кардиомиоцитов: в миокарде человека - 3,12±0,81%; кролика - 2,82±0,39%; крысы - 4,62±0,72%; мыши - 3,43±0,63%.

Анализ фазового состава митотического цикла кардиомиоцитов с подсчетом митотических фигур (Рис. 8, А-Е) указывает на сходный характер соотношения профазы метафазы, анафазы и телофазы делящихся миоцитов в раннем эмбриональном сердце изученных млекопитающих (Табл. 1-4). Учитывая то обстоятельство, что всякий митоз кардиальных миоцитов в трубчатом сердце завершается кариокинезом, соотношение конкретных митотических фигур адекватно отражает соотношение их длительностей.

Рис.7. Митоз сократительного к-миоцита

Онтогенетические преобразования трубчатого сердца сопровождаются резким снижением митотического индекса кардиомиоцитов. На гистологических срезах редукция пролиферативной активности наиболее заметна в трабекулярном миокарде, который по морфологическим признакам дифференцировки опережает компактный и губчатый слои (более подробно см.материалы 6-й главы). Аналогичная закономерность обнаруживается также при авторадиографическом изучении ДНК-синтетической функции кардиомиоцитов: наибольшее количество мышечных ядер, накапливающих 3Н-тимидин, содержится в компактном миокарде, тогда как клетки мышечных трабекул с мечеными ядрами встречаются гораздо реже.

Морфологически кардиомиоциты с мечеными по Н-тимидину ядрами не отличаются от окружающих сократительных клеток по содержанию саркомеров, Z-дисков или их зачатков, характеру вставочных дисков; степень их развития соответствует тому эмбриональному этапу, на котором они были изучены. В ряде случаев миофибриллы в клетках с мечеными ядрами сокращены, что свидетельствует об участии таких кардиомиоцитов в согласованном сокращении. В меченых клетках обнаруживаются признаки интенсивного развития структур, связанных с синтезом и транспортом белка. Ядра обогащены деконденсированным хроматином; в цитоплазме обнаруживается большое количество свободных полисом, а также каналов гранулярного эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи.

Рис.8. Таблица 1. Соотношение митотических фигур

На поздних эмбриональных этапах митотическая активность сократительных кардимиоцитов продолжает заметно снижаться. При этом в миокарде 15-суточных эмбрионов кролика, 16-суточных зародышей крысы и мыши удается обнаружить единичные двуядерные миоциты (Рис.9), патологические митозы (Рис.10; 11). Серийные срезы позволяют идентифицировать сложно распознаваемые признаки патологии митотических фигур (Рис.12 А-Г) в единичных случаях удается обнаружить в компактном миокарде изученных млекопитающих и 3-ядерные сократительные клетки, являющиеся непосредственным результатом патологии митотического деления (Рис.13); ядра в таких клетках находятся в непосредственной близости друг к другу, однако в саркоплазме при окрашивании ловикриловых срезов гематоксилином-эозином отчетливо определяется развитый сократительный аппарат. В последующем количество двуядерных сократительных клеток прогрессивно нарастает, причем наиболее активное увеличение популяции двуядерных кардиомиоцитов наблюдается у кроликов (Рис.14).

К моменту рождения доля сократительных клеток, содержащих 2 ядра, составляет в миокарде кролика 24%, крысы - 12%, мыши - 6%. В эмбриональном сердце человека в указанный период не удается идентифицировать двуядерные кардиомиоциты.

Исследование пентозо-фосфатного пути (уникального внутриклеточного поставщика пентоз для синтеза нуклеотидов) в ткани позднего эмбрионального миокарда изученных млекопитающих обнаруживает чрезвычайно высокий уровень активности 6-фосфоглюконат- и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (бфГДГ и Г6ФДГ). При этом лишь 6-8% общей активности ферментов пентозофосфатного шунта обеспечивается их митохондриальными фракциями (Рис.15; 16). За несколько часов до рождения (28-е сутки эмбриогенеза кролика; 22-е сутки эмбриогенеза крыс; 20-е сутки развития мышей) активность цитоплазматических фракций бфГДТ и ГбфДТ значительно снижается (Рис.17; 18), в то время как активность митохондриальной фракции ГбфДТ двукратно возрастает.

Биохимический анализ организации нуклеопротеидных комплексов ядер, направленный на определение соотношения между содержанием гистоновых белков и дезоксирибонуклеиновой кислоты хромосом, выявил отчетливую онтогенетическую закономерность, заключающуюся в активном увеличении дали гистонов в составе ядерной фракции дезоксирибонуклеопротеидов (Рис.19). В миокарде изученных экспериментальных животных (12-13-е сутки эмбриогенеза кроликов, крыс и мышей) соотношение гистон: ДНК на начальном этапе кардиогенеза составляет в среднем 0.25-0.32 мг/мг. На протяжении эмбрионального развития прогрессивное нарастание указанного соотношения приводит к тому, что содержание гистоновых белков в хромосомах превышает содержание ДНК (Рис.19).

Высокая термодинамическая стабильность ядерных ДНК-протеидных комплексов позволяет провести соответствующий биохимический анализ также в ткани миокарда человеческих эмбрионов. Данные рисунка 19 отчетливо показывают общность тенденций и сопоставимый характер значений соотношения гистон: ДНК в сердце зародышей человека в период с 5-й по 8-в неделю кардиогенеза. Важно отметить, что к концу эмбрионального развития у всех изученных объектов это соотношение достигает константных значений от 1.39 (у мыши) до 1,42 (у человека и крысы), имеющих весьма низкий коэффициент вариации; вполне вероятно, что указанная вариация обусловлена не физиологическими колебаниями у различных объектов, а стандартными погрешностями биохимических методик. Если это действительно так. то близость полученных значений соотношения гистон:ДНК на этапах эмбриогенеза характеризует этот параметр как один из отчетливых биохимических критериев протекания пролиферативного процесса в миокарде, не имеющих видовой специфичности.

К концу эмбрионального периода у изученных млекопитающих происходит существенное снижение митотического индекса миоцитов сердца.

Характерно, что на протяжении начальных эмбриональных этапов кардиомиогенеза у изученных млекопитающих снижение индекса меченых ядер выражено гораздо в меньшей степени по сравнению с редукцией значений митотического индекса (Рис.20). В основе наблюдаемой Дивергенции легат изменения в фазовом соотношении митотического цикла, заключающиеся в выраженном снижении доли ана- и телофаз (Табл. 5-8). Это свидетельствует о том, что определенное количество митозов не завершается кариокинезом - и часть клеточных ядер приобретает удвоенный набор хромосом. Незавершенность митоза в данном случае является механизмом полиплоидизации миокарда, развивающейся сначала по механизму ацитокинетического митоза (формирование двуядерных клеток) с последующим подключением механизма акариокинетического митоза (формирование полиплоидных ядер).

Из таблиц 5-8 видно, что в ходе эмбрионального гистогенеза соотношение митотических фаз изменяется в пользу начальных стадий митоза. Блокирование кариокинеза является не единственным следствием незавершенного митоза; другое важное его следствие - гибель кардиомиоцита в ходе митоза (более подробно клеточная гибель в качестве одного из компонентов гистогенеза рассматривается в следующей главе).

На постэмбриональных этапах кардиогенеза изученных млекопитающих митотический индекс продолжает снижаться, однако скорость этого снижения менее интенсивна, чем в эмбриональном периоде (Рис.21). На протяжении первых пяти дней постнатального развития кролика наблюдается уменьшение митоти-ческой активности на 63.6% (р<0.01) по сравнению с моментом рождения, у крыс и мышей - соответственно на 26.6% (р<0.05) и 29.9% (р<0.01).

Наряду с большим количеством патологических митозов (Рис.22) обнаруживаются и обычные митотические фигуры (Рис.23). За этот же период происходит гораздо более выраженное снижение ДНК-синтетической активности кардиомиоцитов. определяемой по включению радиоактивной метки 3Н-тимидина (Рис.20). По-видимому, это обусловливается постепенно снижающимися потребностями завершенных митотических циклов в отношении репликации генома в сочетании с относительно автономной редукцией механизмов полиплоидизации кардиомиоцитов. в пользу данного предположения свидетельствуют также сдвиги в фазовом спектре митозов, которые заключаются в Дальнейшем  активном снижении доли ана- и телофаз.

18 19
20 21

В исследуемый период сократительные кардиониоциты, находящиеся в стадии профазы, содержат многочисленные тонкие и толстые миофиламенты, хаотично расположенные в цитоплазме (Рис.24). Наряду с ними в дистальных полюсах клетки часто обнаруживаются более организованные фибриллярные пучки, которые состоят из отрезков, близких к длине саркомеров. При этом Z-диски в ряде случаев выявляются в различной степени диссоциации.

22 Патологический митоз

Метафазные миоциты ни в одном из наших наблюдений не содержали Z-дисков в каком-либо виде; пучки миофиламентов полностью утрачивают взаимную ориентацию, характерную для соседних сократительных клеток. Очевидно, что такие клетки не способны к синхронному сокращению в составе мышечных волокон, однако важной чертой митотически делящегося кардиомиоцита, стабильно регистрируемой на этапах раннего постнатального онтогенеза, остается сохраненная связь с соседними клетками (посредством вставочных дисков, насыщенных специализированными контактными структурами).

В ана- и телофазе обращают на себя внимание особенности пространственного распределения диссоциированных миофибрилл в цитоплазме: наибольшее их количество обнаруживается на полюсах удлиняющихся клеток; меньшая часть тонким "поясом" окружает формирующуюся интерзону. На наш взгляд, подобная локализация сократительных нитей является следствием активного нарастания объема гиалоплазмы в центральной (экваториальной) зоне миоцита с последующим оттеснением миофиламентов на периферию.

рис.23 Митотическое деление кардиомиоцита

В отличие от ранних эмбриональных стадий, в первые дни жизни изученных экспериментальных животных центральные участки цитоплазмы кардиомиоцитов содержат небольшое количество гранул гликогена, однако представительство митохондрий становится более выраженным (Рис.25). Практически все митохондрии в указанных участках по своей морфологии соответствуют "низкоэнергетическим" органеллам, описанным И.В.Твердохлебом (1995): они имеют округлую форму, содержат ограниченное количество крист и умеренно плотный или просветленный матрикс. На периферии митотически делящейся клетки, а также на ее полюсах локализуются, в основном, митохондрии с развитым аппаратом крист и плотным матриксом.

На протяжении 2-й недели жизни изученных экспериментальных животных значения митотического индекса продолжают снижаться (Рис.21). Морфологические признаки митотически делящихся миоцитов в целом соответствуют таковым, наблюдающимся у новорожденных животных. Кардиомиоциты, содержащие меченые ядра, обнаруживаются относительно редко и располагаются диффузно в составе стенки желудочков. Количество таких клеток в 4-5 раз превышает количество регистрируемых митотических фигур, что свидетельствует об интенсивном осуществлении диплоидизационных механизмов.

Это подтверждается при анализе динамики накопления двуядерных сократительных миоцитов: к концу 2-й недели жизни крысят и мышат их количество возрастает в 4.5 раза и 14.0 раза соответственно по сравнению с уровнем, установленным у новорожденных животных (Рис.14). Напротив, раннее перинатальное развитие кроликов не сопровождается столь значительным увеличением численности двуядерных кардиомиоцитов, которые еще в позднем пренатальном периоде представлены многочисленной популяцией, составляющей к моменту рождения 24% от числа всех сократительных клеток миокарда. За первые 3 недели жизни кроликов количество двуядерных клеток возрастает лишь на 25%.

т5 т6 т7 т8

 После рождения в миокарде экспериментальных животных существенным образом изменяется направленность Динамики изменений активности цитоплазматических Фракций Г6фДГ и 6фГДГ (Рис.17; 18). При этом удельная активность митохондриальных фракций исследуемых ферментов составляет 42-50% и 27-31% от суммарной активности соответственно для бфГДТ и ГбфДГ (Рис.15; 16).

На протяжении 1-й и 2-й недель постнатального развития крыс и мышей активность цитоплазматической фракции ГбфДГ закономерно снихалается и к 15-м суткам достигает минимального уровня. Начиная с 3-й недели развития наблюдается постепенное нарастание активности цитоплазматических фракций ферментов пентозофосфатного пути, достигающей в зрелый период 7.84 и 15.19 нмоль/мин/мг соответственно для бфГДТ и ГбфдТ в миокарде крысы; 8.26 и 13.36 нмоль/мин/мг - при изучении миокарда мышей. Принципиально сходные сдвиги исследуемых ферментативных активностей обнарухиваются при биохимическом анализе развивающегося миокарда кролика.

24 25

Динамика изменения активности митохондриальных фракций исследуемых ферментов в течение раннего постнатального периода характеризуется разнонаправленными колебаниями, в большинстве случаев не имеющими статистической значимости.

В целом, изучение интенсивности пентозофосфатного цикла, играющего важную роль в процессах липогенеза и нуклеинового обмена, обнаружило резкое снижение активности ферментов пентозофосфатного цикла в миокарде изученных экспериментальных животных на протяжении пренатального периода развития.

Учитывая то обстоятельство, что изучаемый метаболический цикл является универсальным внутриклеточным поставщиком пентоз, используемых для синтеза полинуклеотидов, можно сделать предположение о жесткой взаимообусловленности между интенсивностью реакций пентозофосфатного цикла и пролиферативной активностью кардиомиоцитов. Это предположение подтверждается тем фактом, что после рождения, то есть в период относительно невысоких значений митотической активности кардиомиоцитов. обнаруживается также стабильно невысокий уровень протекания реакций пентозофосфатного цикла. С другой стороны, определенный уровень протекания пентозофосфатных реакций у зрелых животных, достоверно превышающий минимальные значения (установленные в раннем постнатальном периоде), отражают участие указанного цикла в липидном метаболизме миокарда.

При изучении биохимического состава хромосомного аппарата кардиомиоцитов изученных экспериментальных животных обнаружилось, что на протяжении раннего антенатального периода статистически значимых сдвигов гистон:ДНК -соотношения не происходит, тогда, как в последующем наблюдается закономерное нарастание доли гистоновых белков в составе ядерных нуклеопротеидных комплексов, достигая к концу 3-й недели жизни кроликов уровня, сопоставимого со значениями в зрелом миокарде. В сердце развивающихся крыс и мышей дефинитивные величины исследуемого параметра наблюдаются к концу 1-го месяца жизни (Рис.19).

рис.26 Митотические фигуры

Характерно, что в этот же период у крыс и мышей устанавливаются окончательные значения в содержании двуядерных кардиомиоцитов (84% и 90% соответственно от объема миоцитарной популяции), полностью редуцируются завершенные митозы (в указанные сроки нам не удавалось обнаружить митотические фигуры, соответствующие ана- или телофазам, а лишь немногочисленные про- и метафазы) (Рис.26). Ядра кардимиоцитов, накапливающие радиоактивную метку Н-тимидина, обнаруживаются в единичных случаях. Аналогичные сдвиги наблюдаются также при морфо-биохимическом исследовании миокарда кроликов.

Изучение постэмбрионального развития сердца человека, протекающего во внутриутробных условиях, позволяет выявить ряд видовых особенностей, а также установить общие закономерности в осуществлении пролиферационного процесса сократительного миокарда. Так, на фоне закономерно снижающейся митотической и ДНК-синтетической активности кардиомиоцитов в течение плодного периода происходят сопоставимые по своему характеру сдвиги соотношения гистон: ДНК - первоначальная стабилизация параметра (с 8-й по 16-ю нелели) сменяется активным нарастанием до уровня 2,7 мг/мг (к моменту рождения).

Важно отметить, что к концу 1-го месяца жизни кроликов, крыс и мышей (то есть к моменту полной редукции завершенного митотического деления сократительных кардиомиоцитов) значения гистон: ДНК-соотношения имеют близкие величины. Мы уже указывали, что к концу эмбрионального периода у всех изученных млекопитающих, включая человека, соотношение между гистоновыми белками и ДНК в составе храмосоинаго аппарата также достигает константных значений от 1.39 мг/мг (у мыши) до 1.42 мг/мг (у человека и крысы).

Учитывая эти данные, а также классические представления об участии гистоновых белков в осуществлении репликационных механизмов в составе хромосомной ДНК, нам представляется возможным сделать заключение о важной регулирующей функции сопряжения гистон-ДНК по отношению к пролиферативному процессу, причем соотношение между содержанием гистоновых белков и ДНК в составе дезоксирибонуклеопротеида представляется в роли общебиологического критерия пролиферативной потенции миокарда на этапах онтогенеза. В том случае, когда уровень гистонов в 2.7 раза превышает содержание хромосомной ДНК, осуществление митотического деления сократительных кардиомиоцитов становится невозможным, а само соотношение гистон: ДНК остается стабильным на протяжении всего последующего онтогенеза.

В отличие от изученных экспериментальных животных, накопление двуядерных сократительных клеток в миокарде плода человека происходит в крайне ограниченной степени: на 20-й неделе плодного развития доля таких дикарионов составляет лишь 1,4% от всей миоцитарной популяции, а к моменту рождения - 8.1% (Рис.14). Учитывая эти данные, становится очевидным, что в процессе полишюидизации миокарда роль ацитоки-нетического митоза невелика - ведущим механизмом становится не удвоение количества ядер, а формирование удвоенного набора хромосом в составе одноядерных кардиомиоцитов (то есть полиплоидизация собственно ядер).

Весьма интересным представляется вопрос о конкретных способах ядерной полиплоидизации. Учитывая, что фазовый спектр митотического цикла кардиомиоцитов на протяжении плодного периода целенаправленно изменяется в сторону редукции завершенных митозов, мы вправе сделать предположение об активном формировании двуядерных клеток в результате ацитокинетических митозов (подобно тому, как это происходило у изученных экспериментальных животных в раннем постнатальном развитии).   Однако, как видно из динамики численности двуядерных миоцитов, накопления их в миокарде не происходит.   По-видимому, стабильно небольшое количество таких клеток является результатом кинетического равновесия между новообразованием ядер и их слиянием еще до начала цитокинеза. Другими словами, слияние моноплоидных ядер выступает в качестве одного из возможных механизмов их полиплоидизации у человека (но не у других млекопитающих) наряду с обычным удвоением генома в ходе S-периода клеточного цикла с последующим выходом в G0-состояние.

Исходя из приведенных материалов, становится очевидной определяющая роль митотического деления кардиомиоцитов в осуществлении пролиферативного процесса, однако в обобщающую оценку этого неоднородного процесса на этапах позднего эмбрионального и раннего постэмбрионального развития изученных млекопитающих существенную коррекцию вносят также механизмы незавершенных митозов, обусловливающих появление полиплоидных клеток и ядер.

рис.27 Динамика интегрального параметра пролиферации

Расчет интегральных параметров интенсивности пролиферации в сократительном миокарде, проведенный при учете всех изученных показателей и степени их значимости по предложенному нами методу (И.В.Твердохлеб И.С.Шпонька и др., 1996), выявил ряд патогенетических особенностей пролиферативной активности карлиомиоцитов. На рисунке 27 представлена динамика интегральных параметров процесса пролиферации кардиомиоцитов; при этом максимальный уровень пролиферативной активности был выражен через 100%.

Расчеты показали, что в эмбриональном миокарде тенденции в динамиках митотической активности и интегральных параметров пролиферативной активности кар-диомиоцитов отчетливо совпадают, тогда, как в раннем постэыбриональном периоде на фоне чрезвычайно низкого уровня митозов общий пролиферативный процесс имеет тенденцию к активизации. На 14-16-й неделе плодного развития человека, а также на протяжении 1-й недели жизни изученных экспериментальных животных значения интегральных параметров пролиферации достигают уровня 40-50% от максимальных величин, наблюдавшихся в раннем эмбриогенезе млекопитающих. Очевидно, что это явление обусловливается усилением роли полиплоидизационных процессов в осуществлении пролиферативного процесса. В миокарде кроликов, крыс и мышей к концу 1-го месяца постнатального развития уровень пролиферативной активности приближается к нулевым значениям; к концу фетального периода в сердце человека соответствующий уровень составляет около 10% от исходного, что отражает продолжающиеся полиплоидизационные механизмы кардиомиоцитов в наблюдаемый период, а также после рождения.

Таким образом, на основании проведенных морфо-биохимических исследований пролиферативного процесса в миокарде млекопитающих (человека, кролика, крысы, мыши) удалось определить важные органотипические закономерности его протекания на этапах кардиогенеза (Рис.28).

рис.28 Соотношение митозов в миокарде

Наряду с осуществлением ведущего пролиферативного механизма - митотического деления сократительных кардиомиоцитов, постепенно снижающего свою интенсивность,- уже в позднем эмбриональном развитии присоединяется второй механизм - ацитокинетический митоз. Результатом его является ядерная пролиферация с формированием двуядерных клеток.

Наиболее активно этот механизм осуществляется в раннем постэмбриональном периоде, однако в это время к нему присоединяется третий пролиферационный механизм, который заключается в образовании полиплоидных ядер. В кардиомиогенезе человека, в отличие от других изученных млекопитающих, полиплоидизация ядер осуществляется двумя основными способами: 1) за счет редупликации генома в S-периоде с последующим выходом из клеточного цикла; 2) за счет образования двуядерных кардиомиоцитов в ходе ацитокинетического митоза с последующим слиянием новообразованных ядер и формированием одноядерных полиплоидных клеток. Это обусловливает относительно низкое (по сравнению с экспериментальными животными) содержание двуядерных сократительных клеток в миокарде человека в постэмбриональном периоде.

Поддержка
 © 2008-2015 Cardiogenes.dp.ua
© обработка Dr. Andy  
Key words: heart, cardiogenesis, cardiac development. Ключевые слова: сердце, кардиогенез, гистогенез миокарда эндокарда эпикарда, ангиогенез, развитие сердечно-сосудистой системы, васкулогенез, эмбриология, теоретическая кардиология, врожденные пороки сердца, струны сердца. Миокард человека и животных, наука, медицина, ветеринария, сердце.
Rambler's Top100 li MyCounter